上回我们说到，白喉和破伤风经历了从分离病原体，发现外毒素，利用马血清制造抗毒素，再到生产类毒素疫苗的过程。一群科学家们可以说是一代接一代，几乎都是花费了毕生的精力才研发出来了高效的白喉和破伤风的类毒素疫苗。那百日咳疫苗又是怎么加入白喉和破伤风“二人组”，变成鼎鼎大名的“铁三角”百白破疫苗的呢？今天接着上回我们继续往下讲。
01 | 百日咳的犬吠声 |
百日咳是一种具有高度传染性的呼吸道疾病，有较高的发病率和死亡率。1679年，英国医学之父Thomas Sydenham根据百日咳患者在咳嗽时试图闭合声门时产生的特征性的声音，将其命名为whooping cough。在6个月以下的婴儿中，百日咳相关的死亡风险最高。
百日咳患儿特征性的咳嗽声（点击声音标志播放）
Thomas Sydenham
1901年，在巴斯德研究所工作的Jules Bordet和Octave Gengou观察到了感染患者组织中的细菌，并在1906年分离到细菌病原体。
Jules Bordet
Bordet是该研究所位于布鲁塞尔的比利时卫星研究所的创始人，由于他在对百日咳病原体上的工作而获得了广泛认可，后来便将这种细菌以他的名字命名为百日咳博德特菌。但是博德特最大的科学成就却在免疫学领域，他因发现补体而获得1919年诺贝尔奖。
Octave Gengou
02 | 早期的百日咳疫苗 |
在1906年分离出致病细菌后不久便有科学家开发出了百日咳疫苗。尽管历史记录并未提及谁是第一，但很可能也是发现细菌的Bordet和Gengou。
1914年，由于当时疫苗获批并不需要进行设有对照组的功效研究，也不需要将产品效价的标准化，因此来自不同制造商的多种百日咳疫苗产品都在美国获得了许可。这些百日咳疫苗质量参差不齐，美国医学协会在1931年将这些疫苗从其“新的和非官方的治疗方法”列表中删除，直到1944年后才随着效价的可靠提高而才将部分疫苗恢复使用。
与白喉和破伤风类毒素疫苗相对均一的品种不同，当时生产了多种形式的百日咳疫苗。其中大多数被归类为全细胞疫苗，包括各种通过热和/或化学物质灭活和部分解毒的细菌制剂，一部分可能还包括上呼吸道菌群中其他细菌在内的混合制剂。
Louis Pillemer（图右二）
尽管克利夫兰凯斯西储大学的免疫学家Louis Pillemer开发的一种“抗原组分”代表了早期形式无细胞疫苗，但将这类产品视作为是传统的全细胞百日咳疫苗的超越却是数十年以后的事了。
03 | 经过初步改进的百日咳疫苗 |
Thorvald Madsen
在1929年的另一场百日咳的流行中，进一步确认了该类疫苗的保护效果，尽管也观察到了该疫苗的一些严重不良反应。
受到这些结果的鼓舞，西北大学医学院埃文斯顿医院的Louis Sauer使用新鲜分离的强溶血培养物开发了一种更有效的百日咳疫苗。该方法是源于研究发现细菌生长过程中，有四个不同的抗原阶段，而该疫苗就是从处于第一阶段的细菌开发而来的。
Louis Sauer（图后中）
在1928年至1933年之间，Sauer对这种每一剂含有数十亿个灭活细菌的疫苗在1300名儿童中进行了测试。这些孩子中有四个是Sauer的儿子：其中两个在几个月前接种了疫苗，两个尚未接种。结果，当在鼻内接种活百日咳细菌后，只有未接种疫苗的男孩才患上了这种疾病。
虽然Sauer开发出了较前更为有效的百日咳疫苗，并用现在看来非常冒险激进的方法进行了测试。但是，百日咳疫苗的效价依旧没法有效评测，因此还做不到标准化生产，也就做不到推广和大面积接种。
04 | 大急流城的三人组 |
Pearl Kendrick（1890–1980）
Pearl Kendrick和她的同事Grace Eldering在百日咳疫苗的推广和效果确认过程中起到了重要作用，1932年，他们开始在美国密歇根州大急流城的基地合作开发更有效和质量保证的百日咳疫苗，而这个将合作长达40多年。
Grace Eldering（1900-1988）
Kendrick进行了一系列疫苗现场试验，大多数使用铝佐剂疫苗，涉及数千名儿童；试验强调了预先指定的对照组，这种预先设有对照的前瞻试验方法在1930年代获得了认可。Kendrick和Eldering的成功在某种程度上取决于他们组建社区联盟以支持试验的能力。
现场试验的结果令人鼓舞，但还不是决定性的，很大程度上是由于缺乏标准的效价度量。当时的普遍信念是，百日咳疫苗之间功效的差异是由改变产品抗原成分的非标准化细菌学实践造成的。
Margaret Pittman稍后加入了Kendrick和Eldering的小组，她是美国国立卫生研究院（NIH）位于阿肯色州的生物控制实验室的细菌学家，她于1946年开发了一种脑内小鼠保护效能生物测定法，以标准化整个细胞百日咳疫苗的效价。Pittman后来成为第一位负责NIH实验室的女性科学家。
Margaret Pittman（1901-1995）
该团队的进一步工作导致了通过光学方法测定疫苗细菌含量标准的开发，该标准制剂于1958年被作为了国际参考制剂。三位女性科学家致力于研究一种特定病原体及相关的疫苗并取得丰硕成果，在那个科学和医学领域由男人主导的时代非常罕见，赢得了同行的尊敬。
在她们的共同努力下，百日咳疫苗的质量得到了更为一致性的保障。而进一步的现场试验也证明其功效更为稳定。
除了美国，英国医学研究会也在1940-50年代进行一系列随机，安慰剂对照研究，以说服英国当局这种疫苗的价值。研究数据表明，该疫苗在预防疾病方面变得越来越稳定有效。
05 | 百日咳疫苗成为受欢迎的第三者 |
说到这里，我们再来回顾一下，第一种百日咳疫苗于1914年获得麻省公共卫生生物学实验室的许可；白喉毒素和抗毒素的混合物于同年投入使用；明矾沉淀的白喉类毒素于1926年获得许可；破伤风类毒素于1937年获得许可。那么为什么会把百日咳疫苗整合到白喉和破伤风疫苗中，成为鼎鼎大名的百白破疫苗（DTP）呢？我们不妨来分析一下。
首先，白喉和百日咳都是常见的儿童传染病，因此接种的对象是类似的。其次，研究者们发现全细胞百日咳疫苗是有效的佐剂，与单独给药相比，DTP中三种抗原的结合实际上提高了类毒素的免疫原性。再次，铝吸附疫苗可进一步提高免疫原性，同时降低百日咳疫苗相关不良反应的严重程度。
也就是说，全细胞的百日咳疫苗可以作为白喉破伤风类毒素疫苗的佐剂，而用来沉淀类毒素的铝盐又能提高百日咳疫苗的免疫原性，降低不良反应的严重程度。
百日咳疫苗的加入可以说是得到了三者“共赢”的结局。后加入的百日咳疫苗使得1+2大于了3。对于这样理想的结果，人类有什么理由不接受这样的“第三者”呢？
三合一的DTP疫苗于1943年研发，经过严格的评估测定后于1948年3月获得许可。从1940年代末开始，在工业化国家中，使用DTP联合产品对儿童进行主动免疫已越来越成为一种规范。1974年，DTP被列入在发展中国家的扩大免疫计划推荐的基本疫苗中。
06 | 全细胞的百日咳疫苗为何自带佐剂属性 |
看到这里，大家一定会提出这样一个问题：全细胞的百日咳疫苗为何能够自带佐剂属性呢？
这里我们需要把前面关于疫苗佐剂的知识翻出来复习一下了。在佐剂一讲中我们提到了佐剂的四大金刚：铝盐，乳剂，TLR激动剂和皂苷，当时我们把他们比作是制造疫苗的“油盐酱醋”。我们也提到了，新一代的佐剂差不多都是由四大金刚不同成分排列组合构成的。
那么，我们来看看DTwP疫苗中含有什么成分，用于吸附沉淀类毒素的铝盐我们已经知道了，那全细胞百日咳疫苗中含有什么呢？
所谓全细胞，是指在制造过程中，将全部的百日咳细菌菌体经过灭活后制造出来的，几乎包含了所有的细菌组分。因此除了我们需要的百日咳抗原成分外，也包括细菌细胞壁的成分。而细胞壁中含有大量的脂多糖，也就是LPS（Lipopolysaccharide）。
LPS是什么大家还记得吗？LPS是TLR4的激动剂。在实际疫苗佐剂的研制过程中，由于LPS的反应原性过强，科学家将其改造变成了MPL。
而MPL与铝盐结合使用，开发出来的佐剂称为AS04。利用这种佐剂，科学家们已经成功研制了高效的HPV疫苗和血液透析患者的乙型肝炎疫苗。
原来具有70多年历史的百日咳疫苗，同时含有了两种不同的佐剂成分，可以说是现代新型佐剂疫苗的前身。
07 | 全细胞百日咳疫苗的隐患 |
百日咳疫苗的缩写DTP，分别是白喉、破伤风和百日咳英文首字母缩写组合而成的。那么DTwP中的wP就是特指全细胞的百日咳疫苗（whole-cell pertussis vaccine）。全细胞疫苗既使得DTP意外获得了佐剂属性，但是也正是由于全细胞疫苗成分多样，纯度不足，也造成了安全的隐患。
从一开始，全细胞百日咳疫苗就被担心会引起严重的不良反应，特别是DTwP与频繁出现的注射部位反应以及与零星的急性、可逆神经系统事件（如婴儿的高热惊厥）之间的关联。
与大多数预防性疫苗一样，一旦由于广泛的儿童接种疫苗从而使目标疾病的负担降低到非常低的水平后，人们就会开始担心不良反应。对于全细胞百日咳疫苗，这些问题涉及婴儿猝死综合症（SIDS）和慢性脑病。
虽然经过严格的评估没有发现疫苗与SIDS之间存在因果关系的科学依据，也没有足够的关于慢性神经系统损害的确凿证据。但是，针对所谓疫苗引起伤害的诉讼的迅速发展，催生了1980年代的现代疫苗安全运动，最终导致了美国国会立法通过的《全国儿童疫苗伤害法》，以补偿因某些可能与强制性儿童预防接种相关不良事件的不幸家庭。
在评估证据方面，美国国家科学院的咨询机构医学研究所得出的结论是，百日咳疫苗与慢性脑病之间没有明显的病因学联系。但是，由于公众和医生对安全性的持续关注，在某些地区百日咳疫苗的接受度急剧下降。
英国DTwP的使用从1973年的79％骤降到了1978年的31％，在1970年代末期和1980年代初，原本几乎销声匿迹的百日咳又发生了流行，共报道了102,500例百日咳病例，死亡36例。经过多年的疫苗相关疾病控制，随着免疫率的下降，日本和瑞典也发生了类似的百日咳暴发。这些事件进一步推动了亚单位疫苗策略的发展。
08 | 无细胞百日咳疫苗闪亮登场 |
大急流城三人组之一的Pittman曾假设这种疾病很大程度上是由毒素介导的，类毒素可能是一种保护性亚基方法，如白喉和破伤风一样。基于概念上类似的推理，东京日本国立卫生研究院的佐藤裕二及其同事在1980年代初开发了一种无细胞百日咳疫苗（accellular pertussis vaccine, aP）。
与全细胞疫苗不同，这些产品只包含特定的细菌成分，例如甲醛处理过的毒素，丝状血凝素和其他百日咳蛋白质。它们不含有脂多糖（LPS），因为脂多糖被认为是全细胞反应原性的罪魁祸首。
尽管方法上的差异使得很难比较各种无细胞产品的功效，但很明显，它们作为一个整体，对于控制百日咳有效。这些产品目前是发达国家/地区使用的主要或唯一的百日咳疫苗，通常与破伤风和白喉类毒素结合使用，也就是越来越多见的DTaP。
全细胞百日咳疫苗正是因为含有脂多糖等成分才具有佐剂特性，因此用无细胞疫苗替代全细胞疫苗，去除了包括脂多糖在内的成分时，随着不良反应的降低，这个佐剂效应也会减弱。已导致有报道称对某些同时接种的疫苗的免疫反应减弱，但目前还没有证据表明其功效受损。同时，从经济角度来看，无细胞疫苗的制造成本比全细胞疫苗也要贵很多。
09 | 百白破是人群中最广泛使用的疫苗 |
百白破的故事讲到这里要告一段落。白喉，破伤风和百日咳疫苗的研发过程代表了通过主动免疫解决严重细菌感染的早期成功，该疫苗的进化可以说是与免疫学的进步同时发展的。在20世纪中叶开发出每种成分的单一疫苗，并对其进行评估并被接受用于常规公共卫生实践后，DTP组合疫苗便成为人群中使用最广泛的疫苗之一。
几十年来持续接种DTP疫苗所积累得到的成果是各个年龄段的人都普遍具有对三种疾病的免疫力。要保持这种水平的人群免疫力，就需要继续不断为新出生的婴儿人群接种疫苗，同时向青少年和成人提供加强免疫接种。
美国CDC推荐对于青少年、孕妇和成年人应该接种减少了白喉和百日咳剂量的百白破疫苗（Tdap）以维持体内的抗体水平
因此，世界卫生组织全球建议要求对所有儿童进行三种疾病的常规免疫，并继续维持在青春期和成年期的免疫力。无细胞百日咳疫苗的出现有助于降低不良反应，提高依从性。由于这些疾病在世界范围内一些地区仍然很普遍，尤其是百日咳，近年来的流行病学数据提示其在我国并不少见，但往往会被大家忽视，可以说是被忽视的一种传染病，因此应该继续维持百白破疫苗的广泛主动免疫接种。
参考文献
Grabenstein J (2010) Toxoid Vaccines In:Artenstein A(ed) Vaccines: A Biography. Springer, New York
Kathryn M. Edwards and Michael D. Decker（2018）Pertussis Vaccines In:Plotkin’s Vaccines (7th ed) Elsevier， PA. USA
Marta Granström (2011) The History of Pertussis Vaccination: From Whole-Cell to Subunit Vaccines In:Plotkin S.(ed) History of Vaccine Development. Springer , New York
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