LncRNA＋自噬＋p53＝10分文章

LncRNA近年来的热度一直居高不下；

自噬也是相当热门的研究领域，更是于2016年获得诺贝尔生理学或医学奖；

p53基因是近50年来研究最多的人类基因，50%以上的恶性肿瘤中有p53基因突变；

那么，这三者结合在一起能碰撞出怎样的火花呢？

2018年1月2日，青岛大学王昆和阜外医院张健作为共同通讯作者，在 Nature Communications 发表LncRNA研究文章：LncRNA CAIF inhibits autophagy and attenuates myocardial infarction by blocking p53-mediated myocardin transcription(图1)。文章标题就集合了LncRNA、自噬、p53这三个热点，我们一起来看看该研究是怎么做的吧。

图1

文章解读：

自噬（Autophagy）是进化上保守的细胞内降解过程，自噬失调与许多心脏疾病有关，包括扩张型心肌病，缺血性心脏病和心力衰竭等。

LncRNA参与心脏疾病的调节，但LncRNA在调节心脏自噬方面的作用仍然未知。

p53是一种肿瘤抑制蛋白，p53与自噬之间也有着重要的关系。 但在心肌细胞中p53的自噬调节功能仍然大部分未知。

心肌素是一种核蛋白和血清反应因子的转录共激活因子，在平滑肌和心肌中特异性表达。心肌细胞中的心肌素功能障碍触发细胞凋亡。心肌素对维持心脏功能很重要，但心肌素是否能调节心肌细胞自噬尚不清楚。

我们先来看结论：

1、心肌素正向调节心肌细胞的自噬过程，并促进心肌梗塞。

2、p53激活心肌素转录，它通过增加心肌素表达上调自噬和心肌梗塞。

3、LncRNA-CAIF直接结合到p53蛋白并阻断其与心肌素的启动子区域的结合。

该研究表明CAIF能够抑制细胞死亡并通过靶向p53 /心肌素依赖性自噬途径来减弱心肌梗塞。

图2

心肌素介导心肌细胞自噬和细胞死亡

过氧化氢（H2O2）等氧化剂可诱导心肌细胞发生自噬，自噬功能失调引起心肌细胞死亡。在心肌细胞中，H2O2处理增加了自噬(图3a)，随时间增加心肌素表达升高(图3b,c)。表明在H2O2诱导心肌细胞的自噬过程中，心肌素水平升高。敲低心肌素能显著降低H2O2诱导的自噬过程(图3d)。H2O2诱导的LC3-II的表达量随siRNA对心肌素的沉默而显著降低(图3e)。

图3

这些结果表明心肌素激活由氧化应激诱导的自噬性细胞死亡。动物模型实验证实心肌素促进心肌梗塞。

心肌细胞中过表达心肌素会显著提高了Beclin1的mRNA水平，但不影响Atg5，Atg7，Atg10和Atg12等其他自噬相关基因的表达。表明心肌素可能是通过调节Beclin1来调节自噬。

p53激活心肌素转录和表达

分析了小鼠心肌素的启动子区域，发现心肌素具有p53潜在的结合位点（图4a），通过荧光素酶报告基因实验证实p53与心肌素启动子结合（图4b） 。过表达p53增加了心肌素的表达（图4c），敲低p53显著降低了心肌素表达（图4d）。 ChIP检测进一步证实了这一点。这些数据表明p53可以激活心肌素的转录和表达。

图4

敲低p53抑制体外和体内的自噬

p53的敲低有效降低了H2O2诱导的心肌素表达（图5a），显著减少H2O2诱导的心肌细胞自噬囊泡的积累（图5c，d）。另外，p53的敲低减弱了H2O2诱导的LC3-II表达上调（图5e）和细胞死亡（图5f）。 另一方面，p53的过表达增加了H2O2诱导的心肌细胞死亡。这表明p53诱导自噬性细胞死亡。 动物模型实验也证实了同样的结果。这些数据表明p53有助于激活心脏中的自噬信号和心肌细胞死亡。

图5

CAIF阻断p53介导的心肌素转录

为了研究p53介导的心肌细胞和自噬的调节的基本机制，寻找与p53相互作用的LncRNA，利用LncRNA array筛选了一些在心脏中高表达的LncRNAs。qRT-PCR检测了找到了5个差异表达的LncRNA，RNA免疫沉淀（RIP）实验发现在培养的原代心肌细胞（图6a）以及体内，p53抗体显著富集了AK020546，命名为CAIF，结果表明CAIF和p53蛋白之间有很强的相互作用。 RNA pull down实验发现CAIF探针与心肌细胞中的p53（图6b）和小鼠心脏组织中的p53强烈结合，证实CAIF能直接与p53结合。在原代心肌细胞中，CAIF的敲低显著增加了心肌素mRNA和蛋白的水平（图6c，d），而CAIF的过表达显著降低了心肌素的表达 。CAIF的过表达抵消了p53对于心肌表达的促进作用（图6e）。CAIF敲低引起p53的结合显著降低（图6f）。芯片检测结果表明，CAIF敲减增强了p53与心肌素启动子的结合（图6g），并显着增加了心肌素转录活性（图6h）。 CAIF与p53的结合在I/R损伤的心脏中显著降低，这可能导致p53与心肌素启动子的结合增加。综上所述，数据表明CAIF在体内与p53结合，并且这种相互作用阻断了p53介导的心肌素转录。

图6

CAIF在心肌细胞和体内阻断自噬信号

接下来研究了CAIF在心肌细胞自噬性细胞死亡过程中的功能。在H2O2诱导的心肌细胞中，CAIF水平随着自噬程度的增加而显著降低（图7a）。CAIF的过表达显著抑制H2O2诱导的自噬（图7b-d）。此外，CAIF的过表达显著抑制H2O2诱导的心肌细胞中的细胞死亡（图7d）。相反，CAIF的敲低显著增加H2O2诱导的细胞死亡。表明CAIF的表达需要阻断心肌细胞中的自噬性细胞死亡。在I/R损伤的小鼠模型中，CAIF的表达显著降低（图7e）。CAIF的施用减弱了小鼠自噬（图7f）和由I/R损伤诱导的梗塞大小（图7g）。超声心动图结果表明CAIF管理改善了I/R损伤引起的心脏功能失调。总之，这些数据表明CAIF的表达对于抑制自噬诱导的心肌细胞死亡和由缺血性损伤引起的心脏功能障碍是必需的。

图7

CAIF通过控制p53和心肌素来调节自噬

为确认在自噬过程中心肌素是否是CAIF的下游靶标。 我们检测了心肌素的表达，结果显示敲低p53（图8a）降低了CAIF敲低对心肌素表达的促进作用（图8b）。CAIF的敲低显著增强H2O2诱导的心肌素表达，但p53 siRNA的共转染显著减弱CAIF敲低对心肌素表达的作用（图8c）。 我们还发现CAIF的敲低加重了H2O2诱导的心肌细胞自噬和细胞死亡。 然而，p53表达的沉默减弱了CAIF敲低对自噬（图8c）和细胞死亡（图8d）的影响。 总之，这些数据表明CAIF通过调节p53活性和心肌素表达来发挥对自噬和细胞死亡的抑制作用。

图8