「白求恩·肿瘤病理学社」项目由白求恩公益基金会发起，旨在提升相关疾病病理诊断的规范化，进一步扩大和实现精准治疗前的准确诊断。 今天由上海市肺科医院的谢晓枫老师带来肺癌病理诊断系列课程《「肺」常病理时间》第二讲：《非小细胞肺癌ALK的检测方法的比较》的配套学习笔记。 上海市肺科医院 住院医师 硕士 谢晓枫 一、 NSCLC分子检测背景 过去的十几年间，非小细胞肺癌的分子分型改变了其治疗模式；随着靶向治疗的开展，靶向检测需求日益增加； 中国人的腺癌常可见驱动基因改变（EGFR、ALK、ROS-1等等）； 晚期非小细胞肺癌，推荐进行靶向检测。 二、 ALK基因概述 ALK是一种肿瘤相关的基因；ALK蛋白只有在胚胎时期、神经系统的发育过程中可以表达。但成熟的其他组织不会表达ALK蛋白； 2007年学者首次发现EML4-ALK融合基因，并能独立成瘤，而且是强致病基因； ALK基因是非小细胞癌中相对常见的融合基因； 不同的肿瘤当中都可以有ALK的融合，但融合方式可以不一样（与不同的基因partner）；但无论何种融合，都会有磷酸激酶区。针对该区域设计的探针，使得ALK的检测在各个肿瘤当中都获得了成功。 图示， 不同的ALK融合蛋白均表达磷酸激酶区（绿色区域）。NSCLC(非小细胞肺癌)，间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）、炎性肌纤维母细胞肿瘤（IMT）,弥漫大B 细胞性淋巴瘤（DLBCL），肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）很多肿瘤都可显示ALK基因的融合 三、关于ALK+非小细胞肺癌（NSCLC） ALK突变频率在3%~7%之间，中国人群约5%。不同种族间的ALK+ NCSLC发生率相对一致； ALK＋NSCLC患者的中位年龄约为50岁，比其他NSCLC患者更年轻（～70岁）； ～70％ ALK＋NSCLC患者从不吸烟； ≥95％ ALK＋NSCLC患者的组织学类型为腺癌； ALK与其他基因突变互斥，～98％ ALK重排NSCLC患者不存在EGFR或KRAS突变。 四、ALK阳性晚期NSCLC药物获批情况 NCCN指南对ALK抑制剂在NSCLC一线使用的推荐 NCCN推荐ALK阳性非小细胞肺癌的一线治疗药物：塞瑞替尼、阿来替尼、布加替尼、克唑替尼，均为一类推荐。 五、为何推荐检测ALK基因？ 钻石突变—只有检测出来才能发光 ALK阳性NSCLC又称钻石突变---虽然ALK突变频率相对于EGFR还是较低，但是ALK突变的患者其对于ALK抑制剂疗效很好，客观缓解率包括PFS,OS都大大延长。所以一旦有ALK突变，基本会大大受益于靶向治疗，延长生存。只要检测到这颗钻石突变，就给患者带来的新的希望，非常推荐对其进行检测。 六、中国ALK阳性的NSCLC如何定义？ 几个版本的指南对于ALK阳性都有所定义。目前，荧光原位杂交FISH检测、实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测、免疫组织化学（IHC）检测到ALK阳性，统称为“ALK阳性非小细胞肺癌”。 →But：“A bad tumor biomarker test is as bad as a bad drug” ---Current president of ASCO, Daniel F. Hayes 准确检测出ALK融合基因阳性晚期NSCLC患者具有重要临床意义： 避免假阴性； 避免假阳性。 指南推荐下的中国非小细胞肺癌患者的诊断流程。 张绪超,等.中华病理学杂志.2018;47(4) :241-247. 七、ALK融合基因的检测方法概述 ALK fushion gene Detected by FISH 它可以检测到所有的融合类型，但不能区分ALK基因的partner； Detected by PCR 因为是设计的已知突变的引物，所以只能检测到已知的融合类型，不能检测未知融合类型； Detected by ALK protein 免疫组化方法，阳性为棕黄色着色。只要有ALK融合基因便可以表达ALK蛋白，但是也不能区分具体融合的类型； NGS 而ALK检测的过程中，有哪些因素需要考虑？ 检测的各个平台靠不靠谱？ ALK结果怎样标准化的判读？ 如何保证报告的规范性？ NMPA批准的ALK重排检测方法： NGS→燃石（4基因试剂盒）、诺和致源（6基因试剂盒）、世和（6基因试剂盒）、厦门艾德（10基因试剂盒）、华大（3基因试剂盒）、吉因加(3基因试剂盒)、泛生子（8基因试剂盒）； FISH→ALK FISH（雅培），ALK重排检测试剂盒（益善生物）； IHC→VENTANA ALK IHC（罗氏诊断）； RT-PCR（AmoyDx EML4-ALK Real Time PCR—艾德；人EMA4-ALK融合基因检测试剂盒荧光PCR法-雅康博；人类EMA4-ALK融合基因检测试剂盒PCR-荧光探针法—艾德；人EGFR/ALK/ROS-1突变检测试剂盒PCR-荧光探针法—艾德）。 八、 基于DNA的荧光原位杂交（FISH）检测ALK基因重排---金标准 原理： a.直接（或间接）标记了荧光的DNA探针与其互补的目标DNA杂交，通过观察荧光信号的位置来反应基因情况； b.ALK探针采用分离探针，基因易位ALK重排后，红色和绿色信号分离； c.结果判定：50%出现红绿分离或者绿信号缺失（单红）。 样本中≥15％细胞红色和绿色信号分开表示阳性结果 判读标准 记录50个肿瘤细胞的信号模式 大于25个细胞阳性—判为阳性 小于5个细胞阳性—判为阴性 5-25个细胞阳性—可疑阳性—第二位读者（或者重新数50个细胞） 第一位和第二位读者的平均值（或两次技术平均值） 小于15%细胞阳性—阴性 大于等于15%细胞阳性—阳性 阳性结果： 标准：分开的红/绿信号 非典型：分开 + 单个红点 非典型：单个红点 阴性结果： 标准：融合信号 非典型：单个绿点 FISH假阴性的原因：ALK-EML4倒位融合后且伴有不同位置或区段的缺失，而导致红点缺失、或红绿都缺失等情况，导致不满足上述两类阳性信号类型的判读。 FISH检测ALK重排的局限性 对技术和操作的要求较高难度较大； 目前FISH检测的成本相对昂贵； 小活检组织，很难保证每个视野均存在50个以上的肺癌细胞进行判读； FISH检测结果的判读 临界值也存在商榷之处。 →以上局限性导致该方法无法适用于中国ALK阳性非小细胞肺癌患者的大规模筛查和诊断。 九、基于RNA水平融合基因检测——实时逆转录（RT-PCR） 原理 Soda, et al. Clin Cancer Res. 2012 CFDA批准的RT-PCR检测试剂盒 RT-PCR方法的优势： 操作简单，时间短； 结果客观，易于判读，减少人为因素的影响； 除FFPE样本外，还适用其他类型样本组织。 而基于RNA的检测：未包含NSCLC中的罕见ALK 融合类型 在非小细胞肺癌中已确定了几种EML4-ALK 融合变异体，并证明其具有功能活性； 转化需要ALK酪氨酸激酶的活性； 越来越多的罕见融合类型被发现。 RT-PCR检测平台注意事项 仅能检测已知融合； PCR方法对于检测环境及标本要求较高； 阈值附近样本判读需谨慎，必要时换平台验证。 十、基于蛋白的IHC方法 优势：ALK野生型的NSCLC，ALK蛋白几乎没有内源性表达。 ALK基因融合由于驱动性强，所以在肿瘤组织中异质性低，绝大部分病例蛋白表达均匀一致； 即使细胞少，IHC检测出ALK阳性也没有问题； ALK基因融合在NSCLC当中发生频率低，PCR、FISH的方法不适宜大规模的筛查。 缺点： 发生异位之后的ALK表达强度弱，普通的抗体（ALK1或者ALK-SP8或者5A4等）检测ALK融合蛋白敏感性及特异性均较差； 常规IHC结果（不是ventana）不能指导克唑替尼用药。 ALK Ventana 设计原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性----创建一个“二元”的判读系统 Ventana IHC 特点： 使用具有高度敏感性和特异性 的一抗——D5F3 全自动仪操作，充分保证特异 性 独有Optiview扩增技术，充分 保证敏感性 普通IHC(非Ventana D5F3抗体)检测ALK融合基因仅用于初筛 ALK1 敏感性较低（67%） 5A4 敏感性及特异性高（95%-100%），但缺乏更多依据 D5F3（非体外诊断试剂） 1A4 特异性较低（70%） ALK Ventana 的规范化质控 1. 设置阳性和阴性对照 2. 弥漫的、强的、颗粒状着色 常见的判读疑难问题 非肿瘤细胞的假阳性信号： 肺泡巨噬细胞胞浆内的信号吸附 粘蛋白和炎细胞的吸附性着色 正常粘膜组织和坏死组织的非特异性着色 神经源性组织（脑组织、神经纤维和神经节细胞）肿瘤细胞内的假阳性信号 局灶阳性或染色强度不够（任何阳性肿瘤细胞百分比？） 染色定位问题（胞膜及胞核着色） 肝转移灶的假阳性 脉管内的假阳性信号（脉管内没有见到细胞，可能是一些杂质成分阳性） 肿瘤组织常可见到非特异性着色（背景着色，和ALK真正的弥漫强阳性完全不同） 腺腔内的黏液有吸附着色 巨噬细胞非特异性着色 脑转移灶内的神经胶质可以着色（神经系统发育过程中ALK可以阳性，不要当成肿瘤着色，不能看见切片当中有阳性就判为阳性） 染色不均匀—阴性 染色强度不够—阴性 非特异性核着色 胞膜着色 肺腺癌肝转移灶的非特异着色 乳腺癌肝转移灶的非特异性着色 组织固定问题导致的染色不均一 非腺癌其他类型肺癌的染色 鳞癌状细胞癌中的部分阳性； 涎腺型肿瘤细胞中的部分阳性； 神经内分泌癌中的部分阳性。 表现为部分肿瘤细胞出现弱-中等强度胞浆内的阳性信号。 鳞癌当中ALK出现部分斑片状染色 粘液表皮样癌部分的着色 小细胞癌也可出现不同的阳性，但FISH一般为阴性 VENTANA平台注意事项 非腺癌病例判读需谨慎； 富含黏液分泌的病例要格外留意阳性信号的部位及真假； 排除已知的染色元素，包括：肺泡内巨噬细胞、神经纤维及神经节细胞、呼吸道上皮细胞、坏死组织碎片及细胞外黏液吸附； 标本的规范化处理，室内质控，室间质评尤为重要； 结果不确定时，使用其他技术平台行进一步复检。 Case1： 腺癌合并大细胞神经内分泌癌病例（左边深染实性的是大细胞神经内分泌癌，右边腺管状的为腺癌） 大细胞神经内分泌癌SYN染色阳性（CgA+, Syn+, CD56+, TTF1+） 腺癌NapsinA阳性（CgA-, Syn-, CD56-, TTF1+） ALK-D5F3 越来越多文献报道神经内分泌癌可以有ALK基因的易位，部分患者ALK抑制剂治疗有效 Case2： 右上肺肿块4.5cm伴纵隔淋巴结肿大及脑转移； 穿刺病理：免疫组化CgA，Syn，CD56，TTF1强阳性，结合HE形态及免疫组化结果，符合不典型类癌； ALK Ventana及FISH证实ALK融合； 服用Crizotinib治疗后，肺原发灶明显缩小，但12个月后颅内病灶进展。 十一、高通量测序技术（NGS） 采用RNA或者DNA进行检测； 采用RNAseq、多重PCR、target panel测序等技术； 准确度和特异性均较高； 能够发现未知融合突变； 多数以检测交叉跨越read来判断融合突变； 获批基因从4-10个不等； NGS的质控与规范化有待进一步提高； 仪器成本及维护成本高，对技术人员的要求高； 检测费用昂贵，报告时间长。 1. NGS能够检测出特殊的融合类型 国内学者报道过 BIRC6-ALK融合基因 2. NGS可区分融合类型，可发现新的融合 Non-EML4-ALK融合大约占1/4； 至少有30余种不同的partner已被报道。 3. NGS可检测ALK耐药机制 ALK非依赖性的耐药机制： 替代性致癌驱动基因； 这一作用与EML4-ALK无关； 已在ALK融合蛋白的上游和下游识别到替代性致癌驱动基因1–6：KIT（扩增）、EGFR（突变和激活） 、KRAS（突变和扩增）、IGF-1R（表达和激活） 、IRS-1（表达）、MET（激活）、MEK（突变）； ALK依赖性的耐药机制（继发性耐药） ALK激酶区突变； 拷贝数增加。 一代TKI主要耐药突变 L1196M和G1269A。 二代TKI主要耐药突变 G1202R； 二代ALK抑制剂更多出现ALK耐药突变，达50~70%。 ALK继发性耐性突变位点 L1196M，I117N/S，G126A突变对塞瑞替尼敏感。 绿色表示对药物敏感，IC50值越小越敏感 ALK抑制剂耐药机制检测专家共识 对于ALK抑制剂耐药的患者，基因检测内容应由临床医师和分子病理检测医师共同讨论决定（专家共识意见）； 耐药患者进行基因检测时，建议优先应用NGS检测，检测内容包括获得性突变和融合突变类型等（专家共识意见）。 十一、一些工作中的实际问题 不同方法对比 FISH：昂贵的金标准； Ventana：最具性价比的标准； PCR：结果详细； NGS：全面。 Ventana IHC与FISH检测结果比较 很多研究表明VENTANA与ALK FISH检测具有较高的一致性 (1)Jinghui Wang,et al. PLoS ONE 2014 9(7): e101551 (2) Eugen C. Minca,et al. J Mol Diagn 2013, 15: 341-346 (3) Murry W. Wynes,et al. J Thorac Oncol. 2014;9: 631–638 (4) Greta,et al. Arch Pathol Lab Med. doi: 10.5858/arpa.2013-0388-OA （5）J.Ying;et al. Annals of oncology.2013,24:2589-2593 FISH和IHC结果不一致怎么办？ Vysis ALK break-apart（阳性） Vantana阴性（标本固定不佳） 单绿信号 Ventana D5F3阳性 ALK检测样本类型及检测策略优化推荐 ALK检测标本类型 检测标本优先使用肿瘤组织标本（强烈推荐）； 肿瘤组织标本不满足要求时，推荐使用细胞学标本（推荐）； 对于少数客观上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，可尝试血液/脑脊液检测（专家共识意见） 。 ALK检测策略优化 目前，NMPA 批准了 4 个技术平台的 ALK 基因检测随诊断 试剂 ，包 括 ALK Ventana-D5F3 IHC、FISH、RT-PCR、NGS检测平台。专家组强烈推荐这4种方法均可用于ALK基因融合检测； 优先应用Ventana-D5F3 IHC进行ALK检测（强烈推荐）； 当和其他基因（如EGFR、ROS1等）一起检测时，可以联合FISH和RT-PCR,或进行RT-PCR或NGS多基因检测（推荐）。 ALK检测的室内外质控 规范性操作流程及性能验证； 每年两次室间质评； 设置阴性及阳性对照； 专人负责，定期总结与分析。 十二、总结 RT-PCR、FISH、 ALK-D5F3 Ventana IHC 、NGS均可以作为一步法诊断ALK阳性NSCLC的方法； 各检测平台间存在较高的符合率， 但仍然存在IHC/FISH/RT-PCR/NGS检测结果不一致：确保染色结果是准确的；临床与病理积极沟通； 在推断TKI药物疗效及预后、以及预测耐药模式等方面，NGS具有显著的优势； 制定、优化及遵守规范化检测流程才能获得准确的检测结果。
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