背景
预测免疫检查点抑制剂治疗疗效的新兴免疫相关biomarker大致可以分为两类：第一类是和肿瘤新抗原负荷相关的因子，例如微卫星不稳定（MSI）或者高的肿瘤突变负荷（TMB）；第二类是T细胞炎性肿瘤微环境的指示因子（TME）。TME包括了表达在肿瘤和免疫细胞上的PD-L1蛋白；在大多数情况下，响应局部T细胞衍生的γ干扰素和激活T细胞的基因特征，PD-L1的表达量会上调。晚期黑色素瘤中，TMB和CTLA-4抑制剂的临床缓解率相关。在黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌和尿路上皮癌中，TMB和PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂的临床获益相关。相似地在结直肠癌和其它肿瘤中，处于MSI-H状态的肿瘤患者接受PD-1抑制剂治疗后得到缓解。免疫细胞溶解活性相关基因的表达已经表明在几个癌症中和检查点抑制剂的临床获益相关。最近，T细胞炎症基因表达谱（GEP）被报道可以预测PD-1抗体治疗的临床获益。然而，这两大类biomarker间的相互影响还没进行过跨癌种的分析，它们可以独立或联合预测免疫治疗的疗效，或者揭示肿瘤抗原异质性和TME潜在的基因组学或转录组学的特征。
本文中评估了体细胞TMB和派姆单抗PD-1抑制剂治疗的临床缓解之间的关系。该研究的发现队列和验证队列包括了22个癌症，被用于分析TMB和T细胞炎症相关GEP的独立和联合预测作用。除此之外，我们应用大型的分子数据库（例如TCGA）去探索了这两个marker存在或不存在时相关的转录组特征和遗传特征。
方法
研究人群
（1）探索组
来自4个接受帕博利珠单抗单药治疗临床试验的3组队列，分别是：泛癌（pan-cancer）临床试验KN012/028，119例患者，PD-L1阳性：表达量≥1%；头颈鳞癌（HNSCC）临床试验KN012B1，34例患者，PD-L1阳性：表达量≥1%；头颈鳞癌（HNSCC）临床试验KN012B2，73例患者，PD-L1未知；黑色素瘤（Melanoma）临床试验KN001/006，89例患者，PD-L1未知。
315个体22类癌种：头颈部鳞癌、晚期黑色素瘤、晚期实体瘤（涎腺、甲状腺、肺、乳腺、食管、胃肠道、胰腺、胆囊、泌尿生殖道、前列腺、神经内分泌癌，间皮瘤、平滑肌肉瘤）等等。
（2）验证组：数据库（TCGA）
9963个癌症患者包含肿瘤组织RNA的转录组数据（NanoString nCounter gene expression platform）；其中6384个癌症患者同时包含有肿瘤组织DNA的外显子数据（WES）。
TMB和T细胞炎性GEP score计算
（1）TMB：疗前肿瘤组织DNA采用WES，通过过滤条件的体细胞编码区非同义SNV个数的总数。
（2）T细胞炎性GEP score：疗前FFPE肿瘤组织RNA采用含有18个炎性基因的panel靶向基因表达谱测序，标准化基因表达值加权和。
结果
结果-1.1、探索组：TMB、GEP疗效预测作用
●TMB、GEP单独预测作用：更高的TMB或更高的T细胞炎性GEP患者，接受帕博利珠单抗后达到PR或CR的可能性更大。
●TMB、GEP单独预测效能：TMB和T细胞炎性GEP的疗效预测效能较好；且在不同癌种中预测效能相当。
结果-1.2、探索组：TMB、GEP疗效预测作用的关联性分析
●TMB、GEP关联性分析（Spearman）：TMB和T细胞炎性GEP是独立的疗效预测指标，与PD-L1阳性与否无关。
结果-1.3、探索组：TMB、GEP疗效预测作用
●TMB与GEP联合指导分组：两个指标都高的患者（TMBhiGEPhi）的缓解率最高，两个指标都低的患者（TMBloGEPlo）的缓解率最低。
●Responders占比:TMBhiGEPhi+TMBlo or GEPlo＞TMBloGEPlo；以及TMBhiGEPhi＞TMBlo or GEPlo。
●3个队列中的PFSTMBhi＞TMBlo,GEPhi＞GEPlo,TMBhiGEPhi＞TMBlo or GEPlo＞TMBloGEPlo。
●TMB高、GEP高是接受帕博利珠单抗患者PFS的获益因素。
结果-1.4、探索组：TMB、PD-L1表达量疗效预测作用
●TMB和PD-L1表达量相关性分析：PD-L1与TMB独立、联合预测作用，在3个队列中Responder占比：TMBhiPD-L1+＞TMBlo or PD-L1-＞TMBloPD-L1-。
结果-1.5、探索组：其他DNA突变状态疗效预测及与TMB的相关性（有显著性组外显子数据分析）
●预测的新抗原负荷指标在3个队列中均与TMB呈正相关。
●吸烟、紫外线暴露、DNA修复相关（MMR、POLE、APOBEC）因素导致非同义突变增加，TMB增加，以及肿瘤的抗原性增加，从而导致PD-1单抗疗效的增加。
结果-1.6、探索组：其他DNA突变状态疗效预测及与TMB的相关性（无显著性组外显子数据分析）
●Somatic mutation clonality：所有患者的somatic mutation clonality与TMB呈低正相关性（r=0.05；P＞0.05）。
●Copy number variation：研究提示CNV在3个队列中和疗效负相关，疗效预测效能头颈鳞癌组、黑色素瘤组有意义（AUROCs=实体瘤组：0.48，P=no significant；头颈鳞癌组：0.35，P=0.1；黑色素瘤组：0.42，P=0.1）。所有患者的CNV load与TMB呈负相关性，但显著性低（实体瘤组：r=-0.03，P＞0.05 ；头颈鳞癌组：r=0.16，P＞0.05；黑色素瘤组：r=-0.12，P＞0.05）。
结果-2.1、验证组：TMB、GEP疗效预测作用
●T细胞炎性GEP与PD-L1/PD-L2表达量呈正相关性。
●TMB与炎性生物指标（T细胞炎性GEP、PD-L1/PD-L2表达量）不相关。
●MSI-H是TMB-H的子集。
●验证TMB、GEP在TCGA数据库中的疗效预测作用：TMB和GEP指标对于预测帕博利珠单抗临床疗效具有潜在价值。
结果-2.2、验证组：TMB、GEP与其他基因组特征相关性分析
●GEP与其他基因组特征相关性分析：以居中的GEP为参考值，几个之前报道过的与T细胞炎性浸润肿瘤微环境（TME）相关的转录组基因（PD-L1、PD-L2、细胞因子相关、免疫积分、溶细胞作用）与GEP高度相关（r＞0.90）。
结果-3.1、验证集耐药相关性基因：转录组基因与GEP相关性
●转录组：分析TMBhi和TMBlo组中与炎性GEP相关的基因。
●根据基因正态分布分位数与GEP相关性r值绘制曲线上的拐点分组：Set1（r＞0.6）→炎性相关T细胞相关基因；Set2（0.15＜r＜0.6）→血管生成、骨髓浸润相关基因；Set3（-0.4＜r＜-0.15）→基质生成相关基因。
K-均值聚类分析：set细化到module层面（cluster、模块）基因共表达聚类分析相关功能学特征。
●Set1 Module1：GEP正相关、TMB不相关→T细胞炎性相关基因
●Set2 Module4：GEP正相关、TMB正相关→细胞增生相关基因
●Set2 Module5：GEP正相关、TMB负相关→血管生成相关基因
●Set3 Module3：GEP负相关、TMB负相关→基质生成及Wnt信号通路成分相关基因
结果-3.2、验证集耐药相关性基因：外显子组基因与GEP相关性
●在TMBhi（突变频率高）癌种中寻找可能导致免疫逃避（GEP低）的相关外显子组驱动突变。
结果-3.3、TMB、GEP相关基因组特征分析
●TCGA库外显子组数据：在TMB高的癌种中，分析与T细胞炎性GEP负相关（免疫逃避）的驱动基因（已知癌基因过滤条件：p＜0.01，突变频率≥10%）。在肺鳞癌中的KEAP1，肺腺癌中的KEAP1、STK11，结直肠腺癌中的APC等驱动基因与T细胞炎性GEP负相关，可能是肿瘤免疫逃避的驱动基因。Pan-cancer中显著性不如特定癌种中的高，说明这些免疫逃避的驱动基因要在特定癌种中分析。
结论与讨论
●TMB和炎性生物标志物（T细胞炎性GEP和PD-L1表达量）可以作为泛癌种中帕博利珠单抗单药治疗反应的独立预测因子。
●联合使用TMB和炎性生物标志物（T细胞炎性GEP和PD-L1表达量）指导癌症患者分层。
●进一步鉴定两个指标相关的可靶向的肿瘤生物学特征模型。
●为合理构建和评估基于抗PD-1和/或PD-L1的组合治疗方案提供了精准医疗框架。
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