2019年10月31日，国际权威学术期刊《美国人类遗传》（The American Journal of Human Genetics，IF：9.968）在线发表了Human Reproduction Update副主编、山东大学附属生殖医院陈子江教授团队与香港中文大学蔡光伟教授团队合作的一项研究（Genome Sequencing Explores Complexity of Chromosomal Abnormalities in Recurrent Miscarriage）。该研究首次使用低深度高通量全基因组测序技术对复发性流产（recurrent miscarriage，RM）夫妇进行染色体异常诊断。与传统核型分析相比，低深度高通量全基因组测序显著提高了RM患者染色体异常诊出率，确定此类患者流产的遗传原因，为给予其个体化治疗提供指导。我们特别邀请陈子江教授团队，将本研究的背景、选题的初衷以及研究的体会与读者分享，以期为大家带来一些科研启发。
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专注热点 提出设想
RM是指2次或2次以上连续性的自然流产，人群中发生率大约5%。RM是一个重要的全球健康问题，其病因复杂多样，并缺乏特异性临床表现，给全球数百万对夫妇带来了沉重的心理和经济负担。尽管各个国家与学会对RM的定义不尽相同，但是临床医生普遍认为其病因主要包括遗传因素、子宫解剖结构异常、抗磷脂抗体综合征等因素。其中遗传因素较为明确，主要包括夫妇染色体异常和胚胎染色体异常。约2%~4%的RM夫妇中至少一方携带异常染色体（如平衡易位、倒位），这明显高于一般人群中报道的携带率（0.3%），携带者在下次妊娠时可能发生流产的概率高达50%。2018年《中华医学遗传学杂志》发布的《胚胎植入前遗传学诊断／筛查技术专家共识》将RM确定为胚胎植入前遗传学检测的适应证之一，即临床医生可以通过植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing for structural rearrangement，PGT-SR）帮助此类患者排除异常染色体的胚胎，降低流产率。
外周血常规G显带核型分析目前仍是染色体检查的金标准，但是其耗时费力，要求检测人员具有丰富的经验，并且存在分辨率较低的缺点（不能识别小于5 Mb的结构变异），据此，我们提出了一个假设，即是否可以开发一种更简单高效的方法来检测染色体异常呢？
我们研究团队的前期研究（Dong Z, et al. Genet Med. 2016;18(9):940-948; Dong Z, et al. Genet Med. 2018;20(7):697-707）表明，低深度高通量全基因组测序能够发现常规显带核型分析未发现的染色体易位、倒位，并且和染色体微阵列芯片比较，能检测出额外拷贝数变异。因此，我们设想应用这一技术，对不明原因的RM患者外周血进行盲检分析，了解此群体的染色体异常分布情况，以期检测出核型分析未发现的染色体异常，为这部分患者的后续治疗提供依据。
02
层层筛选，分级检测
本研究招募了1090对RM夫妇，共计2180名受试者。采用低深度高通量全基因组测序检测了1077对（98.8%，其中13对夫妇一方的DNA样本由于储存时间长导致降解）夫妇外周血DNA，11.7%的夫妇（126/1077）检测到了127条平衡性染色体异常，其中有1对夫妇两人均确诊染色体倒位。在这126对夫妇中，39.7%（50/126）曾经接受常规染色体核型分析确定为正常核型，而低深度高通量全基因组测序则发现了额外的染色体异常，包括8例平衡易位和42例倒位（图1）。此方法将平衡性染色体异常的检出率从核型分析的8%（86/1077）提高到11.7%（126/1077），并确定18对夫妇存在可能和反复流产相关的拷贝数变异，大大提高了RM患者染色体异常的检出率。
当然，由于受到目前分子技术的限制，对基因组高度重复区域仍存在检测缺陷，此方法无法检测到包括7例罗氏易位在内的10例平衡易位事件。这也提示，可能在现阶段，结合核型分析和低深度高通量全基因组测序，有助于最大限度将染色体异常的检出率提高至14.3%（154/1077）。
图1 低深度高通量全基因组测序确定RM夫妇染色体异常的流程图
在8例平衡易位（图2）中，2例因为相互交换的断裂片段长度小于高分辨显带核型分析的分辨限度而为隐匿性易位，显带核型分析无法确诊。以SD_RSA_11189样本为例，全基因组测序结果显示患者核型为46,XX,t（9;19）（q34.3;p13.3），易位涉及染色体片段大小分别为2.4 Mb和3.1 Mb；根据全基因组测序技术结果，设计PCR引物，使得产物跨越断裂位点，经Sanger测序验证PCR产物为9号与19号染色体的衍生染色体产物；通过对患者重新抽取的新鲜外周血行FISH检测，用带有不同荧光颜色的探针杂交标记交换染色体片段，直观显示衍生染色体，最终证实了全基因组测序技术报告的相互易位结果。
图2 低深度高通量全基因组测序确定的平衡易位
此外，我们对部分再次妊娠的RM夫妇进行随访研究显示，测序核型正常的夫妇再妊娠流产率为22.6%（21/93），而核型异常组再次妊娠后的流产/胎儿异常率高达50%（5/10），这也印证了染色体异常检测对RM夫妇再次妊娠具有指导价值。
同时，我们还为126对低深度高通量全基因组测序分析技术确定存在平衡易位、倒位的夫妇提供了咨询，其中26对选择进行PGT干预的夫妇，与68对染色体正常的RM夫妇相比较，再次妊娠（第一个妊娠周期）发生流产的比例显著降低至5.6%。因此也再次证明了，对RM夫妇进行染色体检测的重要性以及为携带异常染色体的RM夫妇提供再次妊娠干预的价值。
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深入思考 应用临床
本研究结果证实低深度高通量全基因组测序分析技术提高了RM患者的染色体异常检测效率，并为建议“不明原因”RM患者进行PGT检测提供了理论支持。随着平衡易位携带者胚胎检测技术的进步，可以有效减少染色体病夫妇的遗传负荷（如表型正常的携带者的检出）和再次流产风险。本研究丰富和扩大了RM的病因诊断，对一些携带隐匿性平衡易位等染色体结构异常的患者来说，使得由针对胚胎染色体的“普筛”转为针对额外发现的染色体异常进行“精准检测”变成可能。
本研究从临床问题出发，研究内容主要与遗传学的扩大诊断密切相关，因此我们选择投稿到《美国人类遗传》杂志，并于近日正式在线发表。
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循序渐进 服务患者
本研究使用的低深度高通量全基因组测序分析方法，从检出率以及通量（48个样本一次实验）来说，都可以有效提高临床检测效能。这种方法的目标人群主要包括反复流产夫妇、男性不育患者以及疑似患有染色体异常疾病的患者等。未来，研究团队会进一步通过相关临床试验验证，提供证据支持RM患者接受全基因组测序检测并据此进行PGT干预能显著降低其再次妊娠的流产率，结合目前的常规G显带核型分析和低深度高通量全基因组测序，推动相应的行业标准制定。
研究团队简介
本文由山东大学附属生殖医院颜军昊教授供稿
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