CRISPR/Cas9

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CRISPR/Cas9

冀亚明

生物教师

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2020年诺贝尔化学奖授予埃玛纽埃勒·沙尔庞捷和珍妮弗·道德纳两位科学家，以表彰她们在基因组编辑方面做出的贡献，即CRISPR/Cas9基因编辑技术，流程图如下：

①、②、③：构建含Cas9蛋白基因和sgRNA基因的表达载体并导入真核细胞内，使其在细胞中表达出Cas9蛋白和sgRNA，并进入细胞核发挥作用。

④、⑤：Cas9蛋白-sgRNA形成复合物，在sgRNA的引导下Cas9结合于基因组DNA的特定序列，并对其进行切割；

⑥切割后的DNA会在细胞自身DNA修复过程（如同源重组）中修复，该过程中可发生碱基对的缺失、替换或增添（基因突变），也可利用同源重组进行定向敲除；

⑦、⑧改造后的DNA分子经过转录和翻译表达相应的蛋白质。

上述系统的实现得益于CRISPR/Cas系统。

噬菌体专一性侵染细菌，在进化过程中，细菌细胞内形成相应的机制应对噬菌体侵染，如限制修饰系统（也就是现在应用广泛的限制性核酸内切酶）及CRISPR/Cas系统，CRISPR/Cas可看做为获得性免疫系统，广泛存在于细菌及古生菌中, 是细菌等生物长期进化形成的RNA介导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统，相关基因如下：

R为短重复回文序列，S为spacer，起源于噬菌体或外源DNA.（Description of CRISPR/Cas9 development and its prospect in hepatocellular carcinoma treatment，Wu et al. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2020) 39:97）

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是细菌中成簇存在的具有规律间隔的短回文重复序列，存在于细菌的拟核DNA上，其上游存在Cas9基因，编码Cas9蛋白，具有切割DNA的能力（即核酸酶），再上游存在tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA）基因。

（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4051438/）

噬菌体侵染大肠杆菌（E. coli）并将自身遗传物质DNA注入至细胞内部（a、c），在Cas1-Cas2-Csn2（d，相当于机体的固有免疫）的作用下水解为片段，其中一段特异性片段称为protospacer，在该蛋白质复合体的作用下插入到CRISPR序列中（g），作为CRISPR中新增的spacer。该过程可理解为原理同人体免疫中的记忆细胞，对该类噬菌体实现获得性免疫。

当同类型噬菌体再次侵染该E. coli时，获得性免疫机制启动，水解进入细胞内部的噬菌体DNA，过程如下：

（Source: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4051438/）

细胞内部的CRISPR DNA转录形成前体CRISPR RNA（pre-crRNA，多个spacer均会一同转录，2）、tracrRNA基因转录形成tracrRNA（3），同时Cas9基因表达Cas9蛋白（早期称为Csn1，核酸酶），CRISPR RNA（pre-crRNA）、tracrRNA通过碱基互补配对形成氢键，与Cas9蛋白组装形成复合物（4）。在RNA酶（ RNAase III）的作用下pre-crRNA加工形成crRNA，形成成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9复合物。

在形成的各种复合物中，包含了能够与噬菌体DNA特异性识别并结合的crRNA，随后特异性DNA序列会被解旋，与crRNA互补，借助Cas9内切酶切割磷酸二酯键，实现特异性切割噬菌体DNA分子。

CRISPR-Cas9如何特异性切割噬菌体DNA，而对spacer或细菌基因组不进行切割？这要提到另一个特异性序列：PAM（Protospacer Adjacent Motif，候选识别位点的毗邻基序）。PAM为一段长度为3-6bp（碱基对）的特异性序列，常见的如5′-NGG-3′，N代表任意碱基。复合物在发挥作用时，会特异性识别下游含有PAM的外源DNA序列，以保证大肠杆菌自身DNA及spacer不被切割，细节如下叙述。

复合物会对DNA分子进行“扫描”，当在底物DNA上扫描到合适的PAM序列之后，crRNA会与其上游序列进行匹配，随后形成R-loop结构（由一条RNA与DNA杂合链和一条单链DNA所组成，类似于转录过程中的结构），并通过Cas9的两个内切酶结构域切割DNA分子。

（Description of CRISPR/Cas9 development and its prospect in hepatocellular carcinoma treatment，Wu et al. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2020) 39:97）

了解该机理之后，科学家开始对此机制进行改良，实现对其他生物，甚至是真核生物基因组DNA的编辑。为应用该系统进行基因编辑，首先最重要的就是找到tracrRNA-crRNA，2012年首次将sgRNA（single strand RNA，也称为gRNA）引入该系统，用以替代tracrRNA-crRNA的功能，在此前提下满足以下条件即可实现对基因组DNA的编辑：

选定编辑的基因序列在基因组中是特异存在的；

靶位点紧邻着PAM且位于PAM上游；

故当gRNA设计正确时，CRISPR/Cas9就具有很强的靶向性。（当然也有可能脱靶）

为进一步实现该技术在分子生物学的应用，如基因敲除、单碱基编辑等，科学家倾向于改造Cas9蛋白，如上图所示，Cas9蛋白具有两个功能结构域，可选择性的破坏或改造某一功能域使其失活，从而实现切割单链的目的，此类Cas9称为Cas9 nickase， 2013年开始用于实验研究，同时还开发出了dCas9（dead Cas9），此类Cas9不具有酶切活性，能在gRNA的作用下识别相关序列，但不能切割，从而调控基因表达，其抑制基因表达的效率远高于RNAi。

（Description of CRISPR/Cas9 development and its prospect in hepatocellular carcinoma treatment，Wu et al. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2020) 39:97）

a、b分别为突变失活Cas9某一功能域，实现对DNA的一条链进行切割；c是dCas9，只结合DNA分子，不进行酶切，对基因的转录实现正向或负向调控；d为改造的dCas9,加上了胞苷脱氨酶，可将胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，从而实现在DNA复制时发生碱基对替换。

发布于 2021-03-10 15:55

CRISPR 基因编辑 crispr/cas9

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