Carney综合征家系的基因突变研究

合作：[e-mail]

柳杨¹ 孙亮亮¹ 刘彦玲² 李小英² 石勇铨¹

¹第二军医大学长征医院内分泌科

²上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢科 上海市内分泌代谢病研究所 上海市内分泌代谢病临床医学中心

　　Carney综合征（Carney Complex，CNC）是一种临床上罕见的常染色体显性遗传性疾病。临床表现为包括黏液瘤、点状色素沉着、内分泌功能亢进在内的一系列症状和体征。1985年，Carney等首次报道该疾病，后人将之命名为CNC^[1]。该疾病的分子遗传学研究发现该综合征与17q22-24区域相连锁，已证实有45%～73%的CNC家系中存在区域内cAMP依赖性蛋白激酶Aа调节亚基（PRKAR1A）基因突变^[2]。在CNC的各种症状中原发性色素沉着性结节样肾上腺疾病（PPNAD）发病占所有CNC的60%^[3]，是唯一可以遗传的Cushing综合征。上海交通大学医学院附属瑞金医院石勇铨教授团队在本研究中对1例临床诊断为PPNAD的患者进行了详细的家系调查和分子遗传学分析，以明确该家系中基因突变的类型、发病情况及临床特征。

一、研究对象

　　先证者1：女性，22岁。因口唇色素沉着22年，肥胖、闭经、血压升高伴腰背痛4年余收入院。4年前患者因手持重物突发腰背部疼痛，腰椎平片显示胸腰椎多个椎体压缩性骨折（T8-12，L1-3），收入我院骨科住院治疗。后查体发现多毛、全身紫纹，查皮质醇异常升高达517 μg/L，ACTH降低为9.4 ng/L，行肾上腺CT检查提示双侧肾上腺结节样增生，诊断“皮质醇增多症”，遂转入泌尿外科行左侧肾上腺摘除术，术后病理显示“左侧肾上腺结节样增生”。术后随访发现血皮质醇水平稍下降，但水平仍高，ACTH仍低，仍闭经，血压、血糖仍逐渐升高，为进一步诊治于2010年8月收入内分泌科住院治疗。体格检查：口唇、颊黏膜、指端皮肤可见黑色色素沉着斑。Bp 135/85 mm Hg，身高155 cm，体重67 kg。满月脸，水牛背，向心性肥胖，腋下、乳房、腰腹部、臀部、股内侧、小腿伸侧满布紫纹，宽度约为1 cm。入院查24小时尿皮质醇水平升高，血皮质醇升高、节律消失，大小剂量地塞米松抑制试验均不被抑制（见表1）；口服葡萄糖耐量试验（OGTT）提示糖尿病（表2）。性激素水平提示雌激素水平降低，雄激素水平升高。肾上腺CT提示“右侧肾上腺结节样增生，左侧肾上腺术后改变”（见图1、2）。诊断“Cushing综合征， ACTH非依赖性双侧肾上腺结节样增生”。肾上腺术后病理：左肾上腺米黄色、多个结节样肿块，大小约2.5×4 cm。肉眼见：淡黄色碎组织一堆12×12×1.5 cm，内见肾上腺7.0×3.0×2.0 cm，切面黄金、灰褐色、质中。低倍镜下见结节内散在含色素细胞。免疫组化：syn（+），CD57（+），CK（pan）（弱+），GFAP（+），Ki-67（+1%），NSE（+），S-100（-），CgA（弱+）（图3a、3b）。

表1. 先证者1肾上腺皮质功能和Liddle’s试验

表2. 先证者2 OGTT、C肽释放试验、胰岛素释放试验

图1. 先证者1肾上腺CT：双侧肾上腺结节样增生（术前）

图2. 先证者1肾上腺CT：左侧肾上腺摘除术后

图3a 肾上腺皮质节结HE×20

图3b 胞质内散在颗粒状质褐素沉着HE×40

　　后仔细询问病史，发现其母亲、舅舅、外公及舅舅的子女均多数存在口唇、指端的色素沉着，存在家族遗传倾向，且其母亲同样存在高血压、向心性肥胖、糖尿病病史，故进一步将其母亲收入院治疗。

　　先证者2：为先证者1母亲，女性，45岁。因向心性肥胖、高血压、腰背部酸痛酸痛10年余，血糖升高、闭经5年收入。既往有慢性支气管炎、慢性阻塞性肺气肿、肺心病病史10余年。体格检查：口唇、指端见黑色色素沉着。BP 130/80 mm Hg，向心性肥胖，驼背。腰腹部见放射状白色妊娠纹。入院后进行常规生化检查，OGTT提示糖尿病、C肽释放试验、胰岛素释放试验，24小时尿皮质醇水平升高，血皮质醇水平升高并节律消失（表3、4），ACTH降低，雌激素、雄激素均降低。肾上腺CT提示“双侧肾上腺结节样增生”（图4），肾上腺MRI提示“腹部脂肪堆积，双侧肾上腺增生”（图5），子宫附件、乳腺B超未见异常。心脏超声检查未见心房粘液瘤。诊断“1、Cushing综合征 ACTH非依赖性双侧肾上腺结节样增生；2、COPD，肺心病 心功能不全Ⅲ级”。

表3. 先证者2肾上腺皮质功能和Liddle’s试验　

表4. 先证者2 OGTT、C肽释放试验、胰岛素释放试验

图4. 先证者2肾上腺CT：双侧肾上腺增生

图5. 先证者2肾上腺MRI：腹腔内脂肪堆积

　　鉴于该患者Cushing综合征存在家族遗传倾向，且有家族性口唇、指端黑色色素沉着这一标志性体征，遂进一步行家系调查，怀疑其存在遗传性疾病Carney综合征可能。

二、研究方法

　　家系调查：查该家系4代共13名成员，其中男性8人，女性4人。详细询问病史，全面体格检查，测血皮质醇、性激素。

　　分子生物学研究：抽取所有家系成员全血，提取DNA。以Genebank提供的PRKAR1A基因序列为模版，在内含子和外显子交界处设计出包含2～10号外显子的9个外显子相互重叠引物（见表5），由invitrogen生物工程公司合成。PCR扩增：（94℃ 5min，94℃ 30s, 55℃30s，72℃1min）×35个循环PCR。产物纯化后用3730XL 型DNA 测序仪进行测序。用Chromas软件进行序列分析。

表5. PRKAR1A编码区内各引物序列

三、结果

1、家系调查

　　家系中（包括患者）有7人出现典型的口唇、颊粘膜及指端皮肤色素沉着（图6），上述体征均在婴幼儿期即被发现。3代中均有发生，患者7人，其中男性4人，女性3人，男：女=1.33︰1。第Ⅱ代患病人数达75%（3/4），第Ⅲ代患病人数达60%（3/5），第Ⅵ代患病人数达33.3%（1/3）。本组第Ⅰ代患者已死亡。家系中男女均有发病，且无隔代遗传现象，外显率极高，符合常染色体显性遗传的特征。家系图谱见附录（图7）。

图6. 口唇、颊粘膜、指端皮肤色素沉着

图7. 家系图谱（注：Ⅲ4为先证者，Ⅱ3位先证者母亲。均有Cushing综合征）

　　

2、测序结果

　　PCR产物纯化后测序，结果用Chromas软件进行分析见下图（图8），患者及其家系中Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅲ4、Ⅳ1存在PRKAR1A基因intron4 c.440+4delG突变。

图8. 先证者、先证者母亲及该家系正常成员的突变位点

四、讨论

　　本例先证者及其母亲有典型的Cushing综合征临床表现，经肾上腺CT扫描及大、小剂量地塞米松抑制试验证实为原发性于肾上腺的Cushing综合征，先证者手术病理证实为原发性色素性结节性肾上腺疾病（PPNAD），发病较典型。但家系中患者仅表现为口唇、颊粘膜及指端皮肤色素沉着，是否会发生Cushing综合征有待今后进一步随访发现。

　　据报道有45%~75%的CNC家系中，存在导致PRKAR1A失活的杂合突变^[2,3,7,8]。PRKAR1A基因是一个抑癌基因，其编码PKA1α调节亚基蛋白，在正常情况下2个调节亚基（α）与2个催化亚基c构成的四聚体保持稳定。这2个α亚基分别由两条染色体编码，因此，当一条染色体上的基因发生突变使蛋白合成异常时，四聚体的稳定性将受到破坏， PKA处于失活状态，导致下游信号转导通路被持续激活，最终导致体内多种组织出现功能增强，细胞异常生长增殖^[4]。基因突变的位点可能发生在全部的编码外显子和邻近的内含子。大多数已知的突变是点或15bp的小片段的影响编码区的突变。包括无义突变、移框、剪接位点突变^[5]。目前已知的PRKAR1A基因突变有113种^[6]。（图9）

图9. 目前已知的113种PRKAR1Ak基因突变（红色标记部位为热点突变区域）

　　本研究发现的突变是在PRKAR1A基因intron4 c.440+4G突变，为内含子上的基因突变，但突变点靠近剪切区域，在国外文献中曾有报道^[7]。大部分情况下，内含子（introns）是作为增强子调控序列，其本身对翻译产物的结构无意义，但在选择性剪接中扮演重要角色，一个基因可以因此而产生多种不同的蛋白质。临近intron-exon交界的突变的确可以引起错误剪切。从而造成PRKAR1A调节亚基结构和功能的改变。本研究未对先证者PRKAR1A基因产物的生物学活性做进一步检测。该突变位点导致Carney综合征的确切发病机制，需要进一步的功能研究。

　　本家系中符合CNC诊断的有7例，符合常染色体显性遗传疾病的特征。但临床上对本病报道病例数不多，可能与疾病的临床表现多样化，临床鉴别诊断困难。因此，相关的基因检测尤为重要，建议所有CNC患者做基因分析。当证实存在PRKAR1A突变时，建议患者所有的一级亲属做基因检测，以便对本病做出尽早的诊断。本研究中发现的最小患者为7岁。

　　双侧肾上腺切除为目前PPNAD治疗的首选。本例患者仅进行了单侧的肾上腺切除手术。术后血皮质醇水平逐渐下降、骨痛减轻、皮质醇增多的临床症状缓解。但仍存在闭经，皮质醇昼夜节律未恢复，大、小剂量地塞米松抑制试验仍显示不被抑制。这与保留的肾上腺仍存在病变有关。故应在适当的时候进行再次手术。我们将对整个家系进行长期随访，以便获取更多的临床信息。在今后的研究可对该家系PRKAR1A基因产物的生物学活性等进行进一步的研究，增加对该疾病的进一步认识。

参考文献

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　　[1] Carney JA, Gordon H, Carpenter PC, Shenoy BV, Go VL.Thecomplexof myxomas、spottypigmentationand endocrine overactivity. Medicine1985,64(4):270–83.

　　[2] Bertherat J, Horvath A, Groussin L, Grabar S, Boikos S, Cazabat L, Libe R, René-Corail F, Stergiopoulos S, Bourdeau I, Bei T, Clauser E, Calender A, Kirschner LS, Bertagna X, Carney JA, Stratakis CA. Mutations in regulatory subunit type 1A of cyclic adenosine 5'-monophosphate-dependent protein kinase (PRKAR1A): phenotype analysis in 353 patients and 80 different genotypes. J ClinEndocrinolMetab. 2009 Jun, 94(6):2085-91.

　　[3] StratakisCA, Kirschner LS, Carney JA. Clinical and molecular features ofthe Carney complex: diagnostic criteria and recommendations for patientevaluation. J ClinEndocrinolMetab 2001,86(9):4041–6.

　　[4] Stefan E, Malleshaiah MK, Breton B, Ear PH, Bachmann V, Beyermann M, Bouvier M, MichnickSW.NatCommun. PKA regulatory subunits mediate synergy among conserved G-protein-coupled receptor cascades.2011 Dec 20;2:598.

　　[5] Yin Z, Pringle DR, Jones GN, Kelly KM, Kirschner LS.Differential role of PKA catalytic subunits in mediating phenotypes caused by knockout of the Carney complex gene Prkar1a. Mol Endocrinol. 2011 Oct, 25(10):1786-93.

　　[6] HorvathA,BertheratJ,GroussinL,Guillaud-BatailleM,TsangK,Cazabat L, etal.Mutationsandpolymorphismsinthegeneencodingregulatory subunittype1-alphaofproteinkinaseA(PRKAR1A): anupdate.Hum Mutat 2008,31(4):369–79.

　　[7] Bertherat J, Horvath A, Groussin L, Grabar S, Boikos S, Cazabat L, Libe R, René-Corail F, Stergiopoulos S, Bourdeau I, Bei T, Clauser E, Calender A, Kirschner LS, Bertagna X, Carney JA, Stratakis CA.Mutations in regulatory subunit type 1A of cyclic adenosine 5'-monophosphate-dependent protein kinase (PRKAR1A): phenotype analysis in 353 patients and 80 different genotypes.J ClinEndocrinolMetab. 2009 Jun, 94(6):2085-91.

本文经石勇铨教授授权与读者分享

　　

（来源：中华内分泌代谢杂志）