实战：不一样的CRISPR/CAS9靶点活性验证！

引 言

继慢病毒、溶瘤病毒两个系列专题后，从本期开始以“CRISPR/CAS9基因编辑技术”为系列专题，分别从CRISPR/CAS9靶点活性检测方法、CRISPR/CAS9-sgRNA文库的设计和运用以及CRISPR/CAS9基因编辑技术研究进展三个方面展开。

 

 

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摘 要

“CRISPR/CAS9基因编辑技术，已经作为一个常态化的实验技术运用于我们的平常实验中了，其中靶点的有效性验证至关重要，最为经典的检测方法则是T7E1酶切鉴定法，该方法对于切割效率较高的靶点，检测效果明显，而对敲除效率不高的靶点，则效果不佳。那么，针对敲除效率不高但又必须要敲除的靶基因，该如何进行敲除效率检测呢？本文介绍了一种基于基因组PCR产物的sanger法来判定靶点的敲除效率，其灵敏度远高于T7E1酶切法！”

 

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CRISPR/CAS9技术简介

 

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）规律成簇间隔短回文重复，是源于细菌的一种适应性免疫防御，其作用是清除浸入菌体内的病毒或非本体的DNA。后来经过科学工作者的研究、改造和优化，可以实现对原核细胞和真核细胞的基因组进行基因的敲除、敲入、激活或者抑制等操作的一项新的生物技术。

 

CRISPR的基本结构由三个部分组成，即，一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。（1）前导区(Leader)，位于CRISPR结构的上游区域，序列长度在300～500bp之间，其中AT含量较高是启动子序列；（2）重复序列区(Repeat)，序列长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构；（3）间隔区(Spacer)，该序列区穿插在重复序列区(Repeat)之间，序列长度在26～72bp的之间。

 

CRISPR工作原理是CRISPR-derived RNA (crRNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/ crRNA 复合体，此复合体招募CRISPR核酸酶聚集于crRNA配对的序列靶位点处，并且对靶位点DNA双链进行切割，细胞通过同源修复机制对断裂后的DNA双链进行修复，研究者可根据同源修复机制的原理，设计相关的实验对靶基因进行编辑（如：去除和/或添加新基因）。

 

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T7E1酶切鉴定法

 

 T7 核酸内切酶 I （T7E1）识别并切割不完全配对 DNA、十字型结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链DNA 或者以更慢的速度切割或切刻双链 DNA。该酶切割错配碱基 5′ 端的第一、第二或第三个磷酸二酯键。

 

在CRISPR/CAS9阳性克隆检测中常会出现——假阳性和弱阳性。

假阳性多由于T7E1酶识别了非CRISPR/CAS9切割修复导致的碱基错配，譬如，识别了十字交叉，holiday结构等。

弱阳性，主要是由于靶点gDNA的序列结构复杂或异常导致的。

• T7E1酶切法检测突变体实验步骤  

1. PCR扩增出带有突变位点(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，长度约500bp，突变位点最好不位于PCR片段中央，这样将切割出两条大小不同的带。

2. 以混合克隆细胞株gDNA（或者突变体DNA与野生型DNA混合）为模板，经过PCR扩增后的产物，按如下体系进行混合，进行加热变性、退火复性处理。

3. 上述产物用T7E1酶的酶切处理后（37℃水浴， 1h~1.5h），用2% agrose  DNA 电泳鉴定检测。如可以切出两条带的为有效靶点，反之为无效靶点，有效靶点电泳如下图。

 

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Sanger测序

 

Sanger法测序是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。

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实战：不一样的CRISPR/CAS9靶点活性验证

 

针对目的基因或序列的sgRNA构建完毕后，都需要进行该位点的活性检测实验，对于高敲除效率的靶点当然不用担心后续实验问题（如下图泳道2），但对于靶点敲除效率不高的咋办呢？（如下图泳道4）

对于假阳性或弱阳性是否有其他的检测方法？

亦或是否有其他简洁、经济、有效的敲除效率检测方法？ 

有！PCR产物Sanger测序！

1. A基因CON；2. A基因T7E1酶切；3.B基因CON；4. B基因T7E1酶切 ; 5.实验阳性对照。

 

• Sanger测序验证敲除有效流程

gDNA模板PCR产物测序验证法和用T7E1酶切的验证方法的前期实验和要求路线基本一致，PCR扩增出带有突变位点(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，长度约500bp，突变位点最好不位于PCR片段中央，这样将切割出两条大小不同的带。PCR结束后无需进行退火等步骤直接用PCR扩增引物进行Sanger测序验证。

 

• PCR产物测序，发现你所没有发现

PCR产物测序，测序引物为PCR扩增时的正向或反向引物。

测序结果如下：

上行为gDNA序列，其中大写字母部分为靶点，下行为测序结果。这个结果比对，着实伤心！什么突变啊，什么敲除啊，啥子都没有…………

咋办？

不急再看看下面这个图

红色框部分为靶点序列，在靶点序列后面出现了杂峰，套峰！

这说明什么？说明这个靶点是有效的，此处，产生了切割、敲除、NHEJ……

喔喔喔……，看到了希望的曙光！

但是，这么低效率如何才能筛选出基因敲除的细胞呢？

 

• 病毒感染，绝处逢生

导致敲除效率不高的原因除了设计的靶点效率不高外，还有就是sgRNA-CAS9转导进入细胞的效率较低。将sgRNA-CAS9包装进入病毒载体，通过病毒感染目的细胞，提高sgRNA&CAS9的表达量，可以有效的提高CAS9蛋白对目的基因的切割效率。如下图：

 

1.B基因CON；2. B基因T7E1酶切

 

由结果分析可以看出，用sgRNA-CAS9病毒载体感染细胞后，即使用T7E1酶切检测的方法也可以明显的检测出基因的敲除效率。用gDNA模板PCR产物测序检测方法，也可以通过峰图中套峰的高低来判定sgRNA-CAS9的敲除效率。

 

 

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补充：系统设计实验流程，助力实验效率提升

通过合理的实验流程设计，可以很好节约实验时间，提高实验效率，百澳笑笑生的实验流程如下：

 

 

说明：

第4步，工具细胞内（293T、HEPA1-6等）靶点敲除活性验证，本步骤旨在根据需要进行敲除的细胞属性（human、mouse等）选择合适的、转染效率较高的工具细胞，进行靶点敲除效率验证实验。

第7步，目的细胞内，靶点敲除活性验证，本步骤旨在复核验证靶点敲除的有效性，并对后期的单克隆细胞的筛选库的数量做出预判，如果敲除效率较高，在后期的单克隆筛选时可以适当减少筛选细胞数量，反之，则需要增加筛选细胞的数量。

第9步，单克隆细胞检测，本步骤旨在检测基因敲除的结果，看是否将目的基因KO，检测不出其表达，通常用WB检测。此处建议增加一个gDNA测序检测，确认获得的KO细胞是纯合子还是杂合子。如下图：

B基因KO纯合子（单峰）

 

B基因KO杂合子（套峰）