羊肚菌(Morchella spp．)是一类大型珍稀野生名贵食药兼用真菌，具有很高的营养价值和药用价值 J，其干品在市场上价格很高，产品供不应求。目前羊肚菌人工栽培唯一成功的是1982年Ower等发明的羊肚菌( esculenta)人工栽培方法 。自20世纪80年代至今已有很多羊肚菌栽培成功的报道 。但是羊肚菌人工栽培存在着既要促使子实体原基形成，又要激发双核化菌丝体形成的双重困难，栽培难度很大 。因此，商品化生产羊肚菌子实体至今尚未取得突破性成果，羊肚菌人工栽培仍处于试验研究阶段，对其开发利用还停留在野生资源的采集阶段。为此，笔者研究了不同培养基配方对羊肚菌菌丝生长及菌核和子实体形成的影响，旨在为羊肚菌的人工栽培及商品化生产奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种。菌种M1、M2、M3均由陕西省微生物研究所大型真菌课题组纯化并鉴定。
1．1．2 培养基。母种培养基：马铃薯20％ ，葡萄糖2％ ，蛋白胨1％ ，琼脂2％ ，121℃ 灭菌30 rnin。原种培养基：木屑65．0％ ，麸皮20．0％ ，松针粉10．0％ ，蔗糖1．0％ ，石膏1．0％ ，KH2PO4 0．1％ ，VBl10 mg／kg，121 ℃灭菌30 rain。
1．1．3 栽培种配方。按原种培养基的比例，将蔗糖、石膏、KH：PO 和V ，均分别溶于核桃树浸出液、羊肚菌子实体浸出液、香樟木浸出液、新鲜蒜苗浸出液和当年发生过羊肚菌的基脚土浸出液，充分溶解后分别用其拌料，料水比均为1：1
(W／V)，121℃下灭菌30 min，制成5种栽培种培养基，分别将其称为配方A、B、C、D和E。
1．2 方法
1．2．1 菌种的活化。取4℃ 下保存的斜面菌种M1、M2和M3各1支，分别接于PDA斜面上，每个菌种接3支，无菌操作。接好的斜面置于25℃恒温培养箱中培养，直到菌丝长满试管。
1．2．2 原种、栽培种的制备。将上述原种、栽培种的配方按常规方法配料、装瓶，高压蒸汽灭菌2 h，待冷却后无菌操作接人菌株M1、M2和M3菌株的母种斜面，置于25℃ 、弱光下培养，待菌丝满瓶后转接栽培种，1瓶原种接10瓶栽培种，然后于25℃ 、弱光下培养，菌丝满瓶后10 d左右转接栽培袋。
1．2．3 栽培原料的制备。以上5个配方分别按比例调配好，装入20 cm×40 em的聚乙烯塑料袋中，高压蒸汽灭菌2h，待冷却后在无菌条件下分别接入菌株M1、M2和M3的原种，每瓶接5袋，然后置于培养间，自然温度培养，观察其菌丝生长和菌核产生的情况，并待菌丝满袋后7 d左右进行实验室仿生栽培试验。
1．2．4 栽培条件及方法。实验室仿生栽培试验在人工气候箱中进行。栽培方法如下：选择20 cm×20 cm x10 cm通气性好的塑料筐若干，筐底部铺1层枯树叶后浇透水，再撒1薄层石灰粉，分别将发好的菌袋脱袋后小心掰碎放于筐内，最后分别覆盖1～2 cm厚的羊肚菌基脚土(以覆腐殖土为对照)，再在土表喷雾状水，覆盖1层塑料膜以保温和保湿。所覆盖的羊肚菌基脚土是在当年生长过羊肚菌的地方，收集30
cm以内不超过5 em厚的表土层，保持原有的温度，及时加以覆盖。
1．2．5 栽培后的管理。参照文献[5]进行。羊肚菌属于低温型菌类，营养生长阶段的菌丝在3—25℃之间都能生长，但人工气候箱内的温度需控制在15—18℃ 。生殖生长阶段子实体在温度10～20℃都能生长发育，但以13—16℃最适宜。此外，羊肚菌是变温结实性菌类，保持4～l6℃ 的温差刺激有利于子实体的形成。
羊肚菌是喜湿的菌类，整个生长过程中保湿十分重要。羊肚菌菌丝生长要求培养基含水量为70％ ～80％ ，应将栽培料含水量控制在65％ 左右为宜，子实体生长发育要求空气相对湿度在85％ ～95％ 。
羊肚菌的菌丝生长发育对光线要求不严，但原基和子实体的形成需要散射光，因此在菌核形成后期，应给予适当的光照处理。光线过强、过弱都会影响子实体的形成。
2 结果与分析
2．1 不同培养基上羊肚菌菌丝生长情况和菌核的培养特征
2．1．1 菌丝的生长情况。M1、M2和M3 3种菌株在设定的培养基上均能生长，但不同菌种在不同培养基上菌丝颜色明显不同。M1和M2生长初期为浅棕色，尖端近白色，后期变为棕红色。M3生长初期近灰白色，后期变为棕黄色。菌丝有光泽，镜检透明，表面光滑，有隔，无锁状联合，隔中有隔膜小孑L，菌丝呈竹节状，锐角分枝。
从表1可以看出，与菌株M1和M2相比，M3菌株的菌丝生长速度快，满袋早，长势也强；栽培原料不同，菌丝的生长速度差异不明显。在供试的5个配方中，以配方B和E表现最好，菌丝生长最快，平均生长速度可达8．52和8．60mm／d，满袋早且生长势强；3种菌种在配方A、C和D栽培料中都能生长，但差异不明显。这是因为羊肚菌子实体中可能含有某些活性物质，羊肚菌基脚土中可能存在促进羊肚菌子实体形成的共生微生物，二者均对羊肚菌菌丝的生长起了积极的促进作用。
表1 不同培养基上羊肚菌菌丝的生长情况
注：+较差；++ 一般：+++ 优良。
2．1．2 菌核的培养特征。菌核在形成的初期呈白色，较小，以后逐渐聚集变硬，并转为淡黄色，最后变成棕褐色。从表2可以看出，菌株不同，其菌核的形成特征也存在差异。M1菌株15 d时即可形成菌核，且密度大；M2菌株则要在21 d以后方可形成，而且密度小；M3菌株在5种配方上都没有形成菌核。从菌核形成的密度和质量来看，B、E配方较适合M1菌株的生长，产生菌丝早且生长势强。因此，M1菌株具有进
一步分化形成子实体的潜力。
表2 不同 配方培养基上羊肚菌菌核的培养特征
注：+密度小；++ 密度较大；+++ 密度大；一无菌核形成。
2．2 不同培养基上羊肚菌菌核及子实体的形成情况
2．2．1 覆土后不同菌株形成的差异。从表3可以看出，不同菌株在不同培养基上菌核的生成情况存在显著差异。尽管在前期的试验过程中，M3菌株在5种培养基上都没有形成菌核，但在覆土处理之后，该菌株表现出比Ml菌株更为明显的优势；培养12 d以后，在E配方上即有一层白色的“菌霜”形成；进一步培养之后，“菌霜”消失，出现白色小菌核；之后，该菌种陆续在其他4种培养基上产生菌核，且菌核的密度明显比相同培养条件下其他菌种产生的菌核大，直径也较大。
表3 不同培养基覆土后羊肚菌菌核的培养特征
注：+ 密度小；++ 密度较大；+++密度大。
2．2．2 覆土后子实体形成的差异。进一步培养之后发现，M3菌株在培养基D中出现了3个原基，高0．8～1．0 cm，呈指状。M3菌株在其余4种培养基上均未见原基的形成，M1、M2菌株在各个配方上均没有原基产生。M3菌株在培养基D中形成的原基经过后期的培养，并未见子实体的形成。这可能与培养基D中存在促进原基形成的有效成分，而原基未能形成子实体可能与双核菌丝的形成存在障碍有关。此外，该试验还发现，M3菌株在初期培养过程中未见有菌核的形成，但在覆土处理之后产生了菌核。因此推测，羊肚菌基脚土中可能存在促使其生成菌核的有效成分，而覆土之后能有效地产生菌核，可能是羊肚菌子实体形成的必要条件之一。
3 结论与讨论
经过100多年的不懈努力，羊肚菌的研究取得了一定的进展，但其生活史、生理和生态等方面的知识，仍然知之甚少，其营养类型尚存在一定的争议，其结实过程和结实机制尚不明了，羊肚菌商业化栽培至今尚未成功。事实上，在人工培养条件下，从纯菌丝体很容易得到2、3级菌种，选择适宜的2、3级菌种配方，可以产生菌核，但在转入生殖生长方面存在着巨大的障碍。因此，目前羊肚菌栽培的研究中有相同的菌种出菇率不同、相同的环境长势不同、相同的方法产量不同、即使完全满足其生长要求也不一定出菇等的现象发生，这可能也是人工栽培中许多研究者得出的结论不能可靠地加以重复和验证的根本原因。
现有的文献资料表明，覆以原发生过羊肚菌的地表土，能有效地增加其出菇率，可能与覆土中含有刺激羊肚菌结实的有益微生物有关。研究羊肚菌发生的土壤微生物区系，找出有助于结实的关键微生物，采用覆土技术模拟其野生环境，可能是羊肚菌栽培取得成功的有效途径之一。在该研究中，用羊肚菌基脚土加以覆盖，虽未见有羊肚菌子实体的生成，但形成了一定数量的原基。因此，在现有基础上，如何诱导双核化菌丝体的形成可能是今后研究的重点和难点，也是羊肚菌人工栽培取得成功的关键。
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