灵芝的液体发酵与菌种制作

1、生产流程
　　摇瓶培养基制备→灭菌→培养基→灭菌→斜面菌种→接种→摇瓶培养→种子槽发酵→发酵槽发酵→放缸→菌丝和发酵液分离→分别烘乾→培养基配制→灭菌→磨粉直接应用或提取→成品
　　2、斜面菌种制备
　　液体发酵用的斜面菌种，必须生命力强，菌龄期要短，接种后能迅速生长，否则就会感染杂菌，斜面菌种以菌龄10～14天，刚长满试管的为宜。
　　斜面菌种培养基
　　斜面菌种培养基配方种类很多不一定局限哪一种。
　　常用的培养基有：
　　a.PDA斜面培养基 马铃薯200～250g、葡萄糖20～25g、琼脂20～25g、水1000ml、自然pH。
　　制法：马铃薯去皮、切成薄片，称取200g，加水1000ml，煮沸15～20分钟左右，到薯片酥而不烂止，取滤汁，加琼脂，继续煮，待琼脂全部溶解，再加葡萄糖20g，搅拌，使之全部溶解，再补充水至1000ml，装入试管，装量为试管高度的1/5～1/4，塞上棉塞，1.05kg蒸气压保持20～25分钟，灭菌，摆成斜面即可。
　　b.PDA综合培养基 马铃薯200～250g、葡萄糖20～50g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.5g、琼脂20～50g、水1000ml、自然pH。
　　制法与PDA培养基同。
　　c.玉米粉葡萄糖培养基 玉米粉20～25g、葡萄糖15～20g、琼脂20～25g、水1000ml、自然pH。
　　制法：玉米粉40克，加水1000ml，煮沸，保持30～35分钟，不断搅拌，然后用密及纱布过滤，取滤液，以下与PDA培养基制法同。然后灭菌制成斜面。
　　3、摇瓶菌培养
　　培养基 玉米粉1%、葡萄糖3%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、自然PH。
　　制法：玉米粉加些许的水，均匀的搅拌，加热至微沸，保持1hr，取过滤液，再加入其他成分并补充水至1000ml，搅拌，分装於500ml约三角瓶中，每瓶装200ml，用密及的纱布包口，包上不透气纸，灭菌锅1.05kg蒸气压（121℃）30～35分钟灭菌。
　　4、接种方法
　　在无菌箱或接种室中，用接种针挑取试管表面菌种，并将其割碎，接入灭菌的三角瓶培养基中，每管接1瓶，24～28℃摇瓶培养，摇瓶速度每180次/分，培养5～7天，当培养液呈清澈透明状，培养液中充满菌球时，即可终止摇瓶，作菌种发酵灌接种用。
　　摇瓶菌种质量作为优劣的鉴别。
　　摇瓶菌种质量的好坏对发酵有密切关系，优良的摇瓶菌种接种后菌丝生长迅速，不易感染杂菌。
　　优良的摇瓶菌种应该是：
　　①pH.45。
　　②菌球细小、中实、无黑、发酵液稍有粘稠、菌丝分枝密度高、可见芽头和锁状联合、细胞内充满原生质和空泡。
　　③菌丝球湿重应达发酵液重10～18%。
　　④发酵液清澈透明，有灵芝发酵液特有的香味。
　　⑤显微镜检查下无杂菌。
　　5、菌种发酵灌培养
　　培养基 玉米粉2～3%、蔗糖2～3%、葡萄糖1～2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、酵母粉0.2%、自然pH。
　　每100L菌种发酵灌培养液（基）60～65L。
　　玉米粉处理和摇瓶培养方法相同。
　　培养条件如下：
　　接种量10～15%，搅拌速度220r/分，通气量l:1.05～1.1（v/v/分）。缸压0.4～0.5公斤/平方厘米、温度26～28℃，培养时间72～84hr。菌种发酵灌有一级和二级之分，一级菌种发酵灌60～100L，二级菌种发酵灌500L，二级菌种发酵灌接种量10～14%，发酵条件与一级菌种发酵灌同，培养时间70～72hr。
　　6、菌种发酵质量标准与摇瓶培养相同
　　a.发酵灌培养
　　发酵灌培养，目的是为了获得尽可能多的灵芝菌丝体及代谢产物，培养时间短。发酵灌培养时接种量5～12%，发酵灌体积大，一般应达15KL以上，人的发酵灌可达20～30KL，发酵时间72hr左右。
　　培养基：蔗糖4～5%，玉米粉2～3%，酵母粉0.2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.075%，豆油适量。灭菌前pH6.5左右。发酵条件与种子培养相同。
　　放灌标准
　　菌丝无明显芽头和锁状联合，菌丝变细，菌丝原生质聚集，少数菌丝已开始自溶，菌丝含量应达培养基重量15～32%，pH3～3.5。
　　b.发酵过程灵芝菌丝形态变化
　　灵芝发酵过程每8～12hr应取少量发酵液观察，最初阶段菌丝细胞内原生质著生较深，以后逐渐变浅，原生质从分布均匀到凝聚，从开始有明显锁状联合到后期菌丝锁状联合不明显，后期部分菌丝出现自溶。
　　c.放灌后发酵液处理
　　发酵液放出灌，离心或板框压滤，将滤液和菌丝分开，分别烘乾，磨粉。菌丝体粉和发酵液可直接制作药品或保健食品，也可再进一步作提取多醣应用。灵芝菌丝体和发酵液可单独也可合并应用。灵芝菌丝体和发酵液萃取多醣方法与子实体萃取多醣方法相同。
　　d、灵芝深层发酵培养中杂菌感染和防治办法
　　灵芝深层发酵培养需要在无菌的条件下著手。因为培养液中营养成分很丰富且在不断搅拌所以一旦感染杂菌整灌菌种即会遭到污染所以一旦感染杂菌应会造成发酵失败因此深层发酵必须做好杂菌防治工作。灵芝深层发酵培养杂菌感染的环节相当之多，包括菌种带杂菌，设备密封或培养基灭菌不彻底，接种操作不谨慎等等。
　　防治杂菌污染必须做好下列工作：
　　①试管菌种一定要纯，接种前要放在灯下仔细检查，不得有疑是任何杂菌现象。
　　②菌种的年龄要短，生命力要强，要有一定接种量，在发酵灌中生长迅速，灵芝菌丝占优势后，杂菌即不感染。
　　③培养基原料要新鲜，不能有霉变，彻底灭菌，培养基中不可有任何杂物。
　　④设备要经常检修、阀门、管道接种口密封严，不能有渗漏情形发生。
　　⑤空气过滤器内不能受潮，发酵通气时过滤器内要始终保持正压状态，否则培养基会因为流到过滤器内，使过滤器内受潮，此时就必须及时更换内芯。
　　⑥接种操作要细心，做好无菌操作。
　　⑦发酵时防止发生泡沫冒顶。
　　⑧随时取样检验，观察发酵液的色泽和透明度、气味发酵结束时发酵液应清澈、透明，有特殊清香味，无霉味、酒味和臭味，若发现杂菌感染应立即放灌，寻找污原因。
　　7、发酵液杂菌检验方法
　　杂菌检查，一是用肉眼观察发酵液色泽，是否有气泡；二是闻气味，有否异味。但最主要的是进行菌检，在无菌培养条件下观察有否杂菌生长。
　　a.肉汤酚红培养基的检验方法
　　培养基：牛肉膏3～4g、蛋白胨10～12g、葡萄糖3～4g、氯化钠5～6g、酚红溶液2～3ml、水1000ml。
　　灭菌条件：1.05kg/平方厘米、30min。
　　pH：7.0～7.5（灭菌前）。
　　杂菌污染鉴别：发酵液接入培养基内，培养24hr，若色泽由红变黄，培养基混浊，则有受感染。酚红1ml，用95浓度乙醇15ml溶解，再加85ml蒸馏水。
　　b.牛肉膏葡萄糖平板培养基检验方法
　　培养基：牛肉膏3～4g、葡萄糖3～4g、蛋白胨10～12g、氯化钠5～6g、琼脂20～25g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.7（灭菌前）。
　　灭菌条件：1.05kg/平方厘米，30min。
　　培养基灭菌后，倒于培养皿中，平置，使培养基成一平面。在无菌条件下，将发酵液接种在平板培养基上，27～30℃培养48hr。
　　若平板上出现无菌丝样菌落，菌落边缘光滑，菌落呈半透明状或腊脂状或粗糙有皱褶，即表示有酵母污染。若菌落呈菌丝状，色泽多样，即为霉菌污染。
　　灵芝发酵液菌丝体含量测定 取发酵液100ml，用40mesh筛子过滤，去滤液，滤取物用水反覆冲洗，再用砂芯漏斗真空过滤，滤取物在60～65℃烘箱中烘乾恒重、称量，计算其干菌丝体的得率，发酵良好，干菌丝体得率应达1.5～1.8%以上。