杨泽涛 李莉 李剑梅 朱万琴
（辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳 122000）
《食用菌》2012.4
摘要 对卫星灵芝2号菌株的液体深层发酵培养基及培养条件进行了研究。结果表明：最佳发酵培养基为：葡萄糖3%，豆饼粉1.5%，酵母膏1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VB1 1片/L，pH6.0。最佳摇瓶发酵条件为：发酵周期48h、接种量10%，装液量100mL，摇床转速180r/min，温度29℃，初始pH6.0。发酵条件优化后，菌丝体干重可达1.63g/100mL。
关键词 卫星灵芝 菌丝体 液体深层发酵
卫星灵芝2号是1996年经我国“961020”返地式卫星搭载、经过太空诱变的的灵芝菌株。当今人们已经认识到灵芝有多方面的保健作用，市场需求量越来越大，但是野生灵芝资源极其有限，人工袋料栽培基本上依赖于固体菌种，培养时间较长，而食用菌液体菌种的制备是现代生物工程技术在农业领域应用的重大课题，它具有制种快、活力强、污染少、发菌快、成本低等优点，目前已成为当前真菌开发的热点之一[1]-[4]。笔者对卫星灵芝液体发酵培养基及培养条件进行了研究，现将初步的研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 供试材料 ① 灵芝菌株：卫星灵芝2号菌株，由辽宁省微生物科学研究院菌种保藏中心提供，是1996年经我国“961020”返地式卫星搭载后筛选出的太空诱变菌株。② 培养基：a. PDA综合斜面培养基：木屑5%，马铃薯（去皮）20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然。b. 液体种子培养基：玉米面1.5%，葡萄糖1%，酵母膏0.3%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VB1 1片/L，pH自然，蒸馏水配制。c. 基础发酵培养基：玉米粉1%，葡萄糖3%，酵母膏0.3%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VB1 1片/L，pH自然。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种活化 将灵芝斜面菌种接入PDA综合培养基中，于27℃恒温培养4~5d，活化2~3代后备用。
1.2.2 液体种子的培养 用接种针挑取培养4~5d的新鲜灵芝菌4~5块，转入装有100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，29℃、180r/min振荡培养6d。冷藏备用。
1.2.3 菌丝体干重的测定方法 采用重量法。将发酵液用两层纱布过滤，用蒸馏水冲洗菌丝体3次，于恒重的称量瓶中，60℃干燥至恒重。
1.2.4 液体深层发酵培养基的优化
1.2.4.1 碳源筛选试验 分别添加3%的蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉代替基础培养基中的葡萄糖，其它成分不变，以基础培养基为对照，每组设3个重复。接种量为10%，29℃、180r/min振荡培养48h。按照1.2.3的方法测定菌丝体干重。
1.2.4.2 氮源筛选试验 由碳源筛选试验获得最适碳源，分别以0.3%的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵和硝酸铵代替基础培养基中的氮源，其它成分不变，以0.3%酵母膏为氮源的培养基为对照，每组设3个重复。接种量为10%，29℃、180r/min振荡培养48h；按照文中的方法测定菌丝体干重。
1.2.4.3 不同综合碳氮源筛选试验 以优化获得的碳源和氮源，分别以1%的玉米粉、花生粉、花生饼粉、豆饼粉为综合碳氮源，其它成分不变，每组设3个重复。按照上述方法进行发酵培养，测定菌丝体干重。
1.2.4.4 正交试验设计 根据单因素试验结果选取最适碳源、最适氮源，以及综合碳氮源设三水平做L9（34）正交试验进行培养基优化（表1）
表1 正交试验因素与水平
因素
----------------------
水平 豆粉/% 葡萄糖/% 酵母膏/%
1 0.5 1 0.3
2 1 2 0.5
3 1.5 3 1
1.2.5 液体发酵条件的优化
1.2.5.1 培养温度筛选试验 分别于26℃、27℃、28℃、29℃、30℃恒温振荡培养48h，装液量100mL（500mL三角瓶），接种量10%，转速为180r/min，测定不同温度对灵芝菌丝体生物量的影响。
1.2.5.2 初始pH筛选试验 以优化培养基配方配制培养基，灭菌前用1mol/L HCl和1mol/L NaOH调pH至3、4.、5、6、7、8、9和自然，优化条件下振荡发酵培养48h，测定不同pH对灵芝菌丝体生物量的影响。
1.2.5.3 接种量筛选试验 分别在不同接种量（3%、5%、8%、10%、15%、20%）优化条件下振荡发酵培养48h，测定不同接种量对灵芝菌丝体生物量的影响
1.2.5.4 装液量筛选试验 分别在摇瓶（500mL）装液量80mL、100mL、120mL、150mL、200mL和优化条件下振荡培养48h，测定不同装液量对灵芝菌丝体生物量的影响。
1.2.5.5 摇床的转数对菌丝生长的影响 优化条件下，分别以120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、190r/min、200r/min进行发酵试验，测定不同摇床转数对灵芝菌丝体生物量及发酵性状的影响。
1.2.6 卫星灵芝2号菌株液体深层发酵终点的确定 在优化的培养基和培养条件下，对灵芝2号菌株进行液体深层发酵培养，在培养的过程中对生物量、发酵液pH以及菌丝体的长势进行动态观察，确定最佳的培养周期。生物量的测定按1.2.3方法；pH测定用pH试纸；菌丝体长势采用显微镜进行观察。
2 结果与分析
2.1 发酵培养基优化
2.1.1 不同碳源对灵芝菌丝体生物量的影响 碳源是食用真菌最重要的营养，也是重要的能量来源。不同碳源对灵芝2号菌株菌丝体生长的影响有一定差异，结果见图1。结果表明：灵芝对葡萄糖利用的最好，菌丝体生物量达到1.33%。
2.1.2 不同氮源对灵芝菌丝体生物量的影响 不同氮源对菌丝生长均有一定的促进作用（图2）。灵芝菌丝能较好地利用有机氮源，而对无机氮源利用较差。以酵母膏为氮源的菌丝体生物量最高，硝酸铵次之。因此，选择酵母膏作为适宜的氮源。
2.1.3 不同综合碳氮源筛选试验 结果表明：不同综合碳氮源对菌丝体生长的影响有一定差异（图3），以豆饼粉为综合碳氮源时菌丝体干重最高，菌丝体干重1.52%。
2.1.4 正交试验设计优化培养基 正交试验结果见表2，极差分析可见：各因素对生物量影响的次序依次为A（豆粉）>B（葡萄糖）>C（酵母膏），最佳组合是A 3 B 3 C 3 ，优化的培养基基础配方为：豆粉1.5%，葡萄糖3%，酵母膏1%。
2.2 发酵培养条件的优化
2.2.1 培养温度对液体深层发酵灵芝菌丝体生物量的影响 结果见图4。灵芝属高温菌，随着温度的升高菌丝体生长速度加快，其中以29℃条件下菌丝体生长速度最大，培养48h时菌丝体干重达到1.63%。然后随着温度的升高生长速度下降。因此，选择了29℃为该菌株液体深层发酵培养的最适温度。
表2 正交试验
图4 不同培养温度对卫星灵芝2号菌株生物量的影响
2.2.2 初始pH对液体深层发酵灵芝菌丝体生物量的影响 pH对许多酶的催化过程有很大影响，是一项重要的发酵参数，能改变体系酶的环境和营养物质的代谢流。灵芝菌丝体对pH耐受范围比较广（图5），在pH3~9均能生长；在pH5~6及自然的情况下生长良好，PH6.0时菌丝体生物量最高，可见灵芝液体深层发酵的最适pH为6.0。
2.2.3 不同接种量对液体深层发酵灵芝菌丝体生物量的影响 由图6可知，接种量对灵芝真菌菌体生物量有一定影响，小接种量不利于菌丝体的生长，培养48h后，随接种量的增大，菌体生物量逐渐增加，接种量为10%时，菌丝体生物量达到最大，菌丝体干重分别为1.64%，再增大接种量菌丝体生物量反而有所降低。综合考虑，我们选择发酵接种量为10%。
2.2.4 装液量对灵芝菌丝体生物量的影响 灵芝属于好气性真菌，装液量直接影响好氧微生物发酵生产及代谢。在通气良好的条件下，生长旺盛；在通气不良或嫌气条件下菌丝生长不良或根本不能生长。因为培养基装液量越少，溶解在培养基中的氧浓度越高，但有时过多的氧供给会促使菌丝生长过快，营养基质消耗过快，后期营养供应不足，导致菌丝易于衰老，引起菌丝体自溶；装液量越多，通气量就少，培养基中溶解的氧也少，使得菌球直径变大。图7表明：随着装液量的增大，菌丝体生物量增加。当装液量为100mL时，灵芝菌丝体干重达到最高，之后随装液量的增加，菌丝体生物量减少，所以100mL装液量为摇瓶发酵培养灵芝的适宜装液量。
2.2.5 摇床的转速对灵芝菌丝体生长的影响 由表3可以看出，在试验范围内转速慢培养基内的溶氧量少，菌球过大，而菌球中间的菌丝不能接触大量的氧气，处于饥饿状态，影响菌丝的生物量。随着摇床的转速的提高，摇床中的氧含量增加，能促进菌丝生长，菌丝生物量也就高，菌丝球直径变小，当转速为200r/min时菌丝干重最高，但此时发酵液呈粥状，流动性差；同时转速太高，使正在生长的菌丝产生机械损伤，破坏菌丝球的形态，也容易造成液体飞溅到瓶口，造成污染。所以选择转速180r/min为佳。
图5 不同pH对卫星灵芝2号菌株生物量的影响
图7 不同装液量对卫星2号菌株生物量的影响
表3 不同的震荡速度对菌丝生长性状的影响
2.3 卫星灵芝2号菌株液体深层发酵终点的确定 结果表明（表4）：在优化培养条件下，生物量随着培养时间的增加而增加，pH总体趋势均为前期下降后期上升。出现这种变化趋势的原因之一是发酵中期菌丝生长旺盛，消耗发酵液中大量的还原糖而生成酸性物，pH下降到3.5而进入发酵后期菌丝生长缓慢，为满足菌丝生长的需要，利用氮源中氨基酸作为菌丝合成的碳骨架，释放一定的NH4+，且出现菌丝体自溶，导致发酵液中的pH回升，最后稳定在4.0，当培养48h时生物量最大，产率可达到1.63%，此时发酵液中pH3.5。所以最佳发酵周期为48h。
表4 卫星灵芝2号菌株不同时间段的pH、生物量及菌丝体长势变化
3 结论
研究通过对卫星灵芝2号菌株液体发酵培养基及培养条件试验，确定了最佳发酵培养基及培养条件为：培养液葡萄糖3%，豆饼粉1.5%，酵母膏1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VB1 1片/L。pH6.0，接种量10%，装液量100mL，摇床转速180r/min，温度29℃，初始pH6.0，发酵周期为48h，菌丝体干重为1.63%。
食用菌液体菌种生产周期短，菌种萌发封面快，菌龄均匀一致、出菇整齐、品质好。因此，试验研究卫星灵芝液体发酵工艺技术，能解决灵芝固体菌种易革质化的问题，为卫星灵芝工厂化袋料栽培液体菌种的扩大生产打下了良好的技术基础。
参考文献
[1]向黎元，尹复元，吴洵凤.云南野生灵芝及液体培养[J].云南中医学院学报.2000，23（1）：19-80.
[2]陈芳莉，江洁，李曼曼，等.灵芝菌丝体液体发酵产胞外多糖的研究[J].饲料工业，2008，29（16）：40-42.
[3]陈静，夏永辉，梁玲.灵芝有效成份生物活性的研究进展[J].云南中医中药杂志，2009，30（1）：61-63.
[4]许占武，张引芳，朱爱莲，等.真姬菇工厂化生产液体菌种制备工艺的研究[J].食用菌，2011（6）：22-24.
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