1. 天津科技大学生物工程学院（天津 300457）；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所（天津 300308）；3. 黑龙江国誉生物科技发展股份有限公司（牡丹江 158200）
摘要：在摇瓶试验优化黑木耳菌株HA-1液体发酵最适pH、接种量和发酵时间的基础上, 向培养基中添加不同量的刺五加水提液, 考察其对菌体生长与菌体形态、胞内多糖组成及活性的影响。发现在培养优化条件 (初始pH 5.5、接种量8%、发酵时间9 d) 下, 刺五加水提物的添加不仅能促进黑木耳菌株HA-1的菌体生长和菌球直径增长;还能改变胞内多糖的单糖组成与抗氧化性。其综合效果以0.5 g/L的添加量最佳: 菌丝体干重为10.75 g/L, 增长1.23倍, 大型菌球 (2 mm＜D≤3 mm) 的百分比例为94.47%; 单糖组成中的半乳糖摩尔比例为18.15%, 葡萄糖摩尔比例为56.66%。抗氧化性测试的TEAC值 (50.61 μmol Torolox/g) 和ORAC值 (2 047.54 μmol Torolox/g) 最高。
关键词：黑木耳; 刺五加水提物; 液体发酵; 胞内多糖; 单糖组成; 抗氧化性
黑木耳（Auricularia auricula）隶属真菌门、担子菌亚门、木耳目、木耳科、木耳属，是一种公认的高价值药食两用菌[1]。黑木耳多糖作为黑木耳中最引人注目的成分，具有抗血栓[2]、降血糖[3]、延缓衰老[4-5]、抗肿瘤[6]、抗凝血[7]、消炎[8]等活性。黑龙江省农技人员发现使用传统中药材刺五加（Eleutherococcus senticosus）或刺五加渣栽培的黑木耳，肉质厚，味甘平，口感好[9]。实验室前期研究也表明，以刺五加为基质栽培的黑木耳与普通黑木耳在子实体多糖组成与抗氧化性上都有较大差异[10]。
黑木耳的液体发酵生产近年来备受关注。有文献指出适量中药或特殊材料在发酵培养基中的添加，可促进黑木耳的菌丝生长或活性物质产生[11-13]。然而，目前尚未有刺五加对黑木耳液体发酵影响的报道。已有文献也仅聚焦于特殊培养基对菌丝体生长与胞外多糖（或其他代谢产物）产量的影响[14]，缺少对黑木耳菌体形态及胞内多糖组成与活性影响的数据。
试验在摇瓶优化黑木耳菌株HA-1发酵最适pH、发酵时间和接种量的基础上，向培养基中添加不同量的刺五加水提液，考察了其对黑木耳菌株HA-1液体发酵菌丝体生长与菌株形态、胞内多糖组成及抗氧化性的影响。
1.1 材料与仪器
黑木耳菌株HA-1与刺五加木屑均由黑龙江国誉生物科技发展股份有限公司提供。斜面培养基：PDA；液体种子培养基：PDB；摇瓶发酵基础培养基：玉米粉10 g/L，豆粉2 g/L，葡萄糖7 g/L；试剂均为国产分析纯。
UV-1800紫外分光光度计：日本岛津公司；Spectra Max M5多功能酶标仪：美国Molecular Devices公司；Sorvall Evolution RC高速落地离心机：美国Thermo Scientific公司；IKA RV10旋转蒸发仪：德国IKA集团；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：河南省予华仪器有限公司；FD-1-50真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；Agilent 1200 Series高效液相色谱。
1.2 试验方法
1.2.1 培养方法
斜面培养：从母种试管中切出蚕豆大小的菌丝块，接种于斜面的中部，于25 ℃培养7 d。
液体种子培养：将已活化的斜面菌种切碎，接种于液体培养基中，于28 ℃，200 r/min培养4 d。
摇瓶发酵培养：1 L三角瓶中装液200 mL，液体菌种接种量8%，于28 ℃，200 r/min培养。
1.2.2 pH、接种量及发酵时间对菌丝体生长的影响
在接种量2%、发酵时长7 d的条件下，考察不同初始pH（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0）对黑木耳菌株HA-1菌丝生长的影响；在初始pH为5.5，温度28℃，发酵时长7 d的条件下，考察接种量（1%，4%，8%，16%和20%）对黑木耳菌株HA-1菌丝生长的影响。在初始pH为5.5，接种量8%条件下，测定发酵时间（0，3，6，7，8，9和10 d）对黑木耳菌株HA-1菌丝生长的影响。
1.2.3 刺五加水提物的制备：
称取一定量的刺五加，按照1︰50（g/mL）的料液比加入二次水后煮沸3 h，过滤离心，取上清液浓缩冻干。
1.2.4 刺五加水提物对菌丝体生长及胞内多糖的影响
在优化的发酵条件（初始pH 5.5，接种量8%，温度28 ℃，转速200 r/min，发酵时间9 d）下，测定刺五加水提物不同添加量（0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 g/L）对黑木耳菌株HA-1液体发酵菌丝体干重及胞内多糖的影响。
1.2.5 黑木耳菌株HA-1胞内多糖的提取
3 000 r/min 离心10 min，收集黑木耳液体发酵菌丝体，水洗多次后冷冻干燥粉碎。再参考王金凤[15]，SONE等[16]的方法，取一定量的菌丝冻干粉，以1︰40（g/mL）的料液比加入二次水，调节pH为4.0，加入样品质量1%的纤维素酶Cellulase ACCF-4740，在45℃酶解2 h后，离心取上清液，减压浓缩后加入4倍体积的无水乙醇静置过夜，收集沉淀，冷冻干燥所得固体为黑木耳菌株HA-1胞内多糖。
1.2.6 分析方法
菌丝干重测定：取100 mL发酵液，3 000 r/min 离心10 min，收集菌丝体，水洗多次后，于55 ℃烘干至恒重，分析天平称重。
菌球粒径大小测定：参照王琼等[17]测定菌体形态的方法，取5 mL发酵菌液于6 cm×6 cm的玻璃平皿中，加15 mL蒸馏水使菌球悬浮，数码相机拍照，用Image-pro-pluse软件分析菌球当量直径（D）。根据菌球当量直径大小将菌球形态分为小型（D＜1），中型（1≤D≤2），大型（2＜D≤3）菌球。统计不同直径菌球所占总数百分比。
胞内多糖的单糖组成分析：使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色谱（PMPHPLC）法测定单糖组成[17]。取2 mg待测样品，加入1 mL的0.2 mol/L三氟乙酸，120 ℃下水解120 min，冷却，N2吹干，加入50 μL的0.3 mol/L NaOH，再加入50 μL的0.5 mol/L PMP，在70 ℃下反应60 min，衍生结束后，加50 μL的0.3 mol/L HCl中和剩余碱，加1 mL的0.1 mol/L PBS缓冲液和1 mL氯仿萃取，收集上层水相，重复萃取3～4次，上机分析。
液相分析条件为，色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1 mol/L，pH 6.8磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶剂（两者体积比为83︰17）；柱温：30 ℃，紫外检测波长：248 nm；流速：1 mL/min；进样体积：10 μL。
胞内多糖抗氧化性分析：参照张颖等[18]方法，对黑木耳菌HA-1的胞内多糖进行ABTS自由基清除能力与氧自由基清除能力（Oxygen radical absorbance capacity，ORACFL）测试。测试结果均以水溶性的维生素E衍生物Trolox为标准对照，计算每克多糖样品相当于Trolox物质的量（μmol），最终抗氧化性以μmol Trolox/g表示。
2.1 发酵条件对菌丝体干重的影响
pH可以通过影响菌体的细胞膜形态以及营养物质的离子化程度，从而影响菌丝体的生长量。pH过酸或者过碱都会导致菌丝体变异甚至死亡[19]。由图1（a）可知，黑木耳菌株HA-1在所测pH范围4.5～7.0内均能生长，但更偏好弱酸性环境，pH 5.5时菌丝产量最高。故选择pH 5.5作为黑木耳菌株HA-1发酵的最适初始pH。
接种量可直接影响发酵液内的最初活菌数，从而影响菌丝体生长。如图1（b）所示，黑木耳菌株HA-1菌丝体干重随接种量增加而大幅增加，当接种量为8%时，菌丝体干重达到最大，之后，随接种量增加，菌丝体干重反而降低。原因是接种量过高，培养基养分不满足过量菌体生长，导致菌体老化，菌丝体生长量下降[20]。故选择8%作为黑木耳菌株HA-1的最适发酵接种量。
不同发酵时间对菌丝体干重的影响见图1（c）。随着发酵时间的延长，黑木耳菌株HA-1菌丝体产量迅速增加，但在发酵至9 d后，菌丝体干重趋于平衡，说明发酵9 d能满足黑木耳菌株HA-1菌丝体的充分生长，继续延长发酵时间对菌丝体生长意义不大，因此选择9 d为最适发酵时长。
图1 发酵条件对菌丝体干重的影响
2.2 刺五加水提物对菌丝体干重的影响
刺五加水提物对黑木耳菌株HA-1菌丝体干重的影响见图2。刺五加水提物能明显提高黑木耳菌株HA-1的菌丝体产量，其添加量在1 g/L时对黑木耳生长的促进作用达到最大，菌丝体干重为添加前的1.29倍。继续增大刺五加水提物的添加量，对菌丝体生长的促进作用却不再明显。这一结果与先前报道一致。陈丽华与章克昌研究了8种中药对黑木耳液体培养生物量的影响，认为中药对黑木耳的生长存在促进和抑制两种因子，促进因子使其菌丝体干重增大，而浓度的提高使抑制因子的作用增强，从而导致菌丝体干重降低[21]。
图2 刺五加水提物对菌丝体干重的影响
菌株HA-1的菌丝体呈球形，生长规整分散，质地紧密光滑。而刺五加水提物对黑木耳菌丝体生长的促进作用，主要是通过刺激黑木耳菌球直径增长完成的。以0.5 g/L的刺五加水提物添加量为例（见图3）。随着发酵时间的延长，黑木耳菌株HA-1的小型菌球（D＜1）数目在逐渐减小，中型（1≤D≤2）和大型菌球（2＜D≤3）数目逐渐增加。与对照相比，添加刺五加水提物后，黑木耳的大型菌球在发酵中后期（5～9 d）积累速度明显增快。发酵9 d时，大型菌球的比例高达94.47%。
图3 刺五加水提物对菌球形态的影响
2.3 刺五加水提物对胞内多糖的单糖组成影响
使用PMP-HPLC法分析黑木耳菌株HA-1胞内多糖的单糖组成，结果见图4。黑木耳菌株HA-1的胞内多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖和木糖等组成。
图4 黑木耳菌株HA-1胞内多糖的单糖组成
刺五加水提物的添加会影响黑木耳菌株HA-1胞内多糖的单糖组成，添加量不同对单糖组成的影响亦不同（表1）。刺五加水提物添加量为0.5 g/L时，单糖组成中的葡萄糖含量降低，半乳糖含量增加。而在其他添加量下，单糖组成改变均为葡萄糖含量降低和半乳糖含量增加。
表1 刺五加水提物对黑木耳菌株HA-1胞内多糖的单糖组成影响
醛酸木糖岩藻糖0.09.6616.4859.051.332.201.063.376.86 0.58.2718.1556.661.543.731.483.077.10 1.010.0115.2861.582.092.39-3.335.31 1.510.0013.3062.991.732.681.453.154.70 2.05.5110.9471.081.621.99-2.416.45 2.53.4511.8777.16--1.31-6.22 3.04.838.9474.36-2.471.011.776.62刺五加浓度/g·L-1甘露糖半乳糖葡萄糖阿拉伯糖葡萄糖醛酸半乳糖
2.4 刺五加水提物对胞内多糖抗氧化性的影响
使用ABTS自由基及氧自由基清除能力试验考察了刺五加水提物对黑木耳菌株HA-1胞内多糖抗氧化性的影响，其结果见图5。
从图5可以看出，刺五加水提物会导致黑木耳菌株HA-1胞内多糖ABTS自由基清除能力发生变化。当刺五加水提物添加量为0.5 g/L时，TEAC值最高，为未添加前的1.79倍。之后，随刺五加水提物添加量的增加，抗氧化性逐渐降低。氧自由基清除能力的测试结果与此一致。黑木耳菌株HA-1胞内多糖的氧自由基清除能力同样在刺五加水提物添加量为0.5 g/L时达到最强，为未添加前的5.83倍，之后随添加量增加，有下降趋势。由于在刺五加水提物添加量为0.5 g/L时，胞内多糖的抗氧化性达到最大，而此时在胞内多糖的单糖组成上，半乳糖含量最高，葡萄糖含量最低。故推测，低浓度刺五加水提物的加入，改变了HA-1的代谢过程，使葡萄糖含量降低，半乳糖含量增加，而单糖组成的改变导致其抗氧化功能发生相应变化。类似结果已有报道。如Chen等[22]使用玉米秸秆代替普通培养基进行白桦茸深层发酵生产多糖，发现菌多糖的甘露糖和半乳糖比例均有所提高，自由基清除能力也相应地提高。
图5 刺五加水提物对黑木耳菌株HA-1胞内多糖自由基清除能力影响
试验前期先对黑木耳菌株HA-1液体发酵培养条件进行优化，发现最适pH 5.5，最适接种量8%，最适发酵时间9 d。在优化条件下，进一步考察了刺五加水提物对黑木耳菌株HA-1菌体生长形态与胞内多糖的影响。发现刺五加水提物可以通过刺激黑木耳菌球直径的增长而提高菌丝体产量。在刺五加添加量为0.5 g/L时，菌丝体干重为10.75 g/L，增长1.23倍。单糖组成中的半乳糖含量摩尔比例为18.15%），葡萄糖含量摩尔比例为56.66%。抗氧化性测试的TEAC值（50.61 μmol Torolox/g）和ORAC值（2 047.54 μmol Torolox/ g）最高。
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Effects of Aqueous Extract from Eleutherococcus senticosus on Submerged Fermentation of Auricularia auricular and Its Intercellular Polysaccharide
Zhang Ying1,2, Zeng Yan2, Qiu Guang-jun3, Zhang Ying2, Yu Peng1, Sun Yuan-xia2*
1. Tianjin University of Science & Technology (Tianjin 300457);
2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences (Tianjin 300308);
3. Heilongjiang Guoyu Biological Science and Technology Development Co., Ltd. (Mudanjiang 158200)
Abstract：Based on the experimental result of the optimum conditions for submerged fermentation of Auricularia auricular HA-1, the effect of aqueous extract from Eleutherococcus senticosus on the biomass and mycelium morphology of Auricularia auricular HA-1 as well as the composition and activity of its intercellular polysaccharide was studied. It was found that under the optimum condition (initial pH of 5.5, inoculum amount of 8% and incubation time of 9 d), the addition of aqueous extract from Eleutherococcus senticosus could not only improve the growth speed of Auricularia auricular HA-1, increase the diameter of the mycelial pellets, but also change the monosaccharide composition and antioxidant activity of its intercellular polysaccharide. The best effect was observed at the addition of 0.5 g/L extract as: The biomass was 10.75 g/L in dry weight with an improved yield of 1.23 times, the content of big mycelial pellets (2 mm＜D≤3 mm) was 94.47%. The obtained intercellular polysaccharide had 18.15% galactose and 56.66% glucose by mole ratio in the monosaccharide composition. Moreover, the intercellular polysaccharide showed the highest antioxidant activity of 50.61 μmol Torolox/g and 2 047.54 μmol Torolox/g in TEAC and ORAC assay, respectively.
Keywords：Auricularia auricular; aqueous extract from Eleutherococcus senticosus; liquid fermentation; intercellular polysaccharide; monosaccharide composition; antioxidant activity
*通讯作者；基金项目：863计划（No.2013AA102102）
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