养细胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顾小孩一样仔细对待，爱护她，呵护她，必要时用真情感动她。除此之外，你还要有足够的技巧去驾驭她。
装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗 3-5 遍，再用双蒸水漂洗 3 次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌 20 min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、灭菌时保持密封。Tip 头插到盒子里，双层牛皮纸包好后直接高压灭菌就好。
我说的除菌主要是指溶液的除菌。如 PBS、HEPES 之类的一些缓冲液和不含葡萄糖的盐溶液，可以配好以后直接高压灭菌。而大部分的溶液由于成分限制必须过滤除菌。我们实验室需要过滤除菌的溶液有：胶原酶、胰酶、各类血清、抗生素、G-418 溶液、各类培养基、各类生长因子、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。
1XPBS：氯化钠 8 克、氯化钾 0.2 克、磷酸二氢钠 1.15 克、磷酸氢二钾 0.2 克，加水至一升，调 pH=7.4。这里我认为 PBS 的 pH 是最重要的一环，不可大意。
HEPES 溶液：8 克氯化钠、0.3 克氯化钾、0.135 克磷酸氢二钠、1 克葡萄糖、5 克 HEPES 加水 900 ml，调 pH=7.4。
抗生素：我们主要用青霉素和链霉素，一般用 1X PBS 稀释至 1X100000 单位，-20℃储存，用时直接加入培养基，工作浓度一般为 1X1000 单位。
G-418：1 克包装的 G-418 瓶中加入10 ml HEPES溶液彻底溶解，过滤除菌后分装于 EP 管，-20℃ 保存。
谷氨酰胺：L-谷氨酰胺 29.2 克，加 Hanks BBS 1000 ml溶解，配成 200 mmol/L 过滤除菌，4 度保存，工作浓度1～4 mmol/L。加有谷氨酰胺的培养液在 4℃ 冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
1 X EDTA-胰酶：0.25 克胰酶加 0.1 克 EDTA 完全溶解于 500 ml 1XPBS中，过滤除菌后分装于50 ml离心管中，一管 4 度备用，其他 -20℃ 保存。我不太主张配成 10X 的母液，因为胰酶反复冻融后，效果会差很多。（EDTA 很难溶，必要时候可放置过夜。）
MTT：sigma 公司出产，用 1XPBS 配成50 mg/ml待用。MTT 毒性很大，配置时务必小心。
各类培养基：现在我们实验室都是买 GIBICO 的粉剂自己配制。包装盒上会有配制方法，以及加碳酸氢钠的量。按说明来就是了。需要注意的是在配培养基前，最好先确保碳酸氢钠充分溶解，避免局部 pH 偏高或偏低。
再一个就是水的使用，一般配盐溶液，用三蒸水即可，而配制培养基务必用超纯水，并在使用前要高压灭菌。
我养过的细胞株不多，权当抛砖引玉。一般来说大部分细胞系我们都用高糖 DMEM 10% FCS 培养，我们实验室用该培养基的有：HepG-2、NIH-3T3、A549、Hela、C2C12、COS-7。特殊的，如 P19Cl6 用α-MEM 10% FCS，SGC-7901 用 RPMI-1640 10% FCS，293 细胞则用 MEM 热灭活的马血清。
对于贴壁不是很紧的细胞，用 45% DMEM 45% α-MEM 10% FCS 有奇效。
实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射 30 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转 5 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以 70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45 °角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
定期检测下列项目： CO2 钢瓶之 CO2 压力 、CO2 培养箱之 CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)、无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及 HEPA 过滤膜，预滤网（300 小时/预滤网，3000 小时/ HEPA）、液氮罐中的液氮高度。 水槽可添加饱和硫酸铜溶液，并定期换水。
血清必须贮存于–20℃，若存放于 4℃，不要超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将 40～45 ml 分装于无菌 50 ml 离心管中，预留此膨胀体积之空间，以免容器冻裂。
一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
瓶装（500 ml）血清一定要逐步解冻: 4℃ 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃ 直接至 37℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
热灭活是指 56℃，30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份 去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。以我们实验室做的对照试验看，未灭活血清效果的确要好些。
一般步骤为：真空泵吸走培养基，1X PBS 漂洗两次，加入1 ml EDTA-Tripsin（100 mm 皿为例），37 ℃ 放置数分钟，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量血清，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，离心后加入新鲜培养基，按比例转移至新皿。
细胞的传代最重要的是胰酶处理时间，若胰酶处理太久，容易造成细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。我谈谈个人经验：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理 5-6 min，C2C12、COS-7、NIH-3T3 比较容易脱落，2 min 足矣，P19Cl6 和 293 细胞贴壁不紧，可在 PBS 漂洗后，直接换新鲜培养基打散。
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