细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

细胞培养是杂交瘤制备单克隆抗体过程中必不可少的实验操作，细胞培养是一个困难重重的事情，多少英雄都在细胞培养上自挂东南枝，本文就细胞培养的步骤及注意事项做一描述。

步骤

一、复苏

1. 把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。 2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。 3. 把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。 4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。 5. 3天换一次培养基。

二、传代

1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。 2. 把原有培养基吸掉。 3. 加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。 4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。 5. 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。 6. 把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。 7. 倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。 8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

三、 冻存

把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。 冻存液的配制： 70%的完全培养基+20�S+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

注意事项

严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换 (灭菌水加进去)。 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个 30 分钟。 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过 2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。 大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。 最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天吧，感觉都长了几层出来，培养基都黄了。抱着试一试的心情传了一次，又坚强的活过来了。当然，状态肯定也差的很了。培养细胞前，可以看看细胞特点说明书，包括细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。 不同细胞生长周期不同，有的生长很快，比如说 MDA-MB-231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了，有的又是特别慢，等的人心焦，BT474 就是，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满，所以就要在培养细胞的过程中多多摸索了。 对于娇弱的细胞，就得细心呵护了，胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间，每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。 冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。 培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。 在生物安全柜 (或者超净台)，枪头，血清管，血清，培养基，瓶子都足够好，并且细胞房有良好的卫生措施 (比如隔离服，手套，口罩，清洁，HEPA 等等) 且不违法操作原则的情况下，你其实很难污染。 上述条件不完备的情况下，就要多注意无菌操作了：比如要用的东西提前拿到台子里照啊 (不过这个其实也不大好，因为会挡住紫外线)，使用前 SDS+酒精擦台子，进出超净台一定要酒精擦手。 至少 1 天看 1 次。 现在一大型药企养细胞做检测，工作量很大，很多地方都没办法非常仔细的做。但是两年下来只出现过一次污染，总结一下心得： 1. 好的洁净室，空调系统跟得上。 2. 好的生物安全柜，硬件跟的上。 3. 瓶子移液器吸头大都是进口，耗材跟的上。除了这些就是自己的操作习惯了。 4. 任何东西不要从敞开的瓶口上面经过。 5. 虽然酒精灯会干扰安全柜气流但是还是需要一盏用来勤烧瓶口。 6. 实验时所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。
养细胞就像打仗 细胞饲养涵盖的内容太广了，而且不同种类细胞的饲养难度以及技术要求不同，肿瘤细胞，成纤维细胞，上皮细胞... 甚至各类干细胞... 每一种都有自己的生长要求。如果只是单纯的一般性操作，大同小异，个人觉得练好技术的情况下注意几点就好: 1. 各种无菌，从培养基到操作过程再到培养箱，时刻注意无菌。本人曾经所在的实验室出现过大规模污染并最终导致所有细胞集体毁灭... 教训惨痛。 2. 培养基的配制一定要做好梯度摸索并详细记录，否则细胞死都不知道怎么死的。 3. 尽量提高操作熟练度，减少培养皿在培养箱外的滞留时间，细胞很脆弱，经不起折腾，不像人，热了有空调，冷了能烤火。 4. 把握好培养基更换的时间，不同细胞类型时间不同，早了浪费试剂，晚了可能全军覆没。 5. 经验很重要，养细胞的很多经验你是无法在公开的书籍和资料上找到的。多向实验室前辈学习，他们会让你少走很多弯路，真的。 养细胞就像打仗，知彼知己，百战不殆。只有了解你养的对象，才能把他养好。