报道专家｜上海东方医院 李强教授
整理｜衣上云
来源｜医学界呼吸频道
患者出现不明原因的发热、咳嗽，到底是什么病原体感染啊？
检查做了，抗菌药用了，就是不见效。真是焦头烂额，急白了头发！
别紧张，别紧张！
中华医学会呼吸病学年会2018（CTS2018）暨第十九次全国呼吸病学学术会议上，来自上海东方医院的李强教授告诉你：介入呼吸病学技术联合NGS（二代测序技术）诊断呼吸道感染病原体就是这么简单！
先来几个病例
CASE 1
患者男性，47岁，因“发热伴咳嗽气促5天”入院。
既往史：患者2017.06月诊断为血小板减少性紫癜。
诊治经过：入院后给予口服美卓乐40mg qd，达那唑0.2g bid，奥克20mg qd治疗。胸部CT示：双肺弥漫性磨玻璃样密度增高影。支气管镜下未见异常。肺泡灌洗液病原学及细胞学检查，传统取材检查结果为（－）。第2次取材时遂以介入呼吸病学技术取材，取得支气管肺泡灌洗液送NGS，结果检出人类疱疹病毒4型(EBV)，423条DNA序列，得出诊断：EBV感染、病毒性肺炎。经抗病毒治疗后，患者症状改观。治疗前后患者胸部CT比较：
治疗前胸部CT
抗病毒治疗后胸部CT
CASE 2
男，33岁，肾移植后5年，无明显诱因出现发热，伴干咳3天。
给予泰能抗感染治疗3天后，患儿仍然有发热，并出现呼吸困难。
这个病例常规作了染色、图片，另外送了NGS，灌洗液现场快速评价，找到卡氏肺孢子菌。
肺泡灌洗液与组织NGS结果比较，得出结论，对大部分非细菌性感染而言，组织里面的DNA含量明显高于灌洗液。因肺孢子虫进入肺泡后，很快吸附在肺泡上皮上，所以，组织里面检出的病原菌要比肺泡灌洗液里多得多。该患者经SMZ+卡泊芬净联合治疗一周后CT所示肺部病变得到明显改善。
CASE 3
患者，男，24岁。美国伊利诺伊州读研究生，研二。
主诉：反复咳嗽4月，发现肺部占位2周余。
现病史：患者4月前受凉后开始出现反复咳嗽，白天为甚，不伴鼻塞流涕，无发热，无胸闷气促，无头痛头昏，无恶心呕吐，无全身酸痛，无腹痛腹胀腹泻等不适，之前未引起重视故未就诊，此次入院前2周，患者至邵逸夫医院就诊，2018.07.18完善胸部CT示右上肺炎性病灶首先考虑：TB？两肺散在斑点状。患者遂至杭州市红十字会医院就诊，痰图片未找到抗酸杆菌，T-SPOT（－），于2018.07.20行支气管镜检查，灌洗液送检结果：XPERT结合分枝杆菌阴性：结核杆菌DNA（－），非结核分枝杆菌DNA（－），隐球菌荚膜抗原（－）。
患者于2018.08.03日于浙江省第一医院复查胸部CT示：右肺上叶占位，肺癌可能，伴周围阻塞性炎症。
患者及家属不能接受肺癌的诊断，遂到上海东方医院就诊，李强教授给予以下两种检查：
1、肺泡灌洗液送高通量病原学基因检测(NGS)；
2、超声引导下活检取病变组织送高通量病原学基因检测(NGS)。
以上两份结果皆提示皮炎芽生菌。
明确病因后，医生给患者用伊曲康唑200mg bid po治疗2周，复查CT病灶稍缩小。
芽生菌病是种什么病？
美国中部及东南部、俄亥俄州、密西西比河谷以及加拿大部分区域是芽生菌病流行区，由热带双相真菌皮炎芽生菌引起。
临床表现各异，包括无症状感染（至少占50%，这支持一些人有自然免疫力的假说）、类似感冒样疾病、急性或慢性肺炎、暴发感染性成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和播散性感染。潜伏期为30～45d。肺脏几乎总是最先受累。近来发现芽生菌病的25～40%有肺外疾病。
镜下：特征性芽生酵母支持芽生菌病的诊断。
一些免疫力强的急性肺部芽生菌病患者可自愈，而所有免疫受损患者和有进行性肺部或肺外疾病者均需治疗。治疗药物包括两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑和氟康唑。两性霉素B是有生命威胁或CNS受累或唑类治疗无效的免疫受损患者的首选用药，另外它还是唯一可用于孕妇的抗真菌药。
伊曲康唑是无生命危险、无CNS系统症状的芽生菌病的初治选择。
下文提要
NGS概述；
下呼吸道感染临床诊治所面临的困境；
NGS在呼吸道感染病原诊断中的价值；
介入呼吸病学技术联合NGS在呼吸道感染病原诊断中的价值。
NGS概述
“Next-generation” sequencing technology“下一代（二代）测序技术”，又称“高通量测序技术”(High-throughput sequencing)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
在感染性疾病里，大家经常见到的mNGS则是基于宏基因组的二代测序技术。具有病原菌阳性检出率高、快速、无偏倚等特点，被用于探究疑难感染病的病因。
病原宏基因组诊断方法学优势：
NGS实验过程：
1、样本准备(sample fragmentation)；
2、文库构建(library preparation)；
3、测序反应(sequencing reaction)；
4、数据分析(data analysis)。
随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。
比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(de novo sequencing)，获得该物种的参考序列，为后续研究奠定基础。
对有参考序列的物种，进行全基因组重测序(resequencing)，在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。
二代测序技术(NGS)的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。
该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降，以人类基因组测序为例，上世纪末进行的人类基因组计划花费30亿美元解码了人类生命密码，而第二代测序使得人类基因组测序已进入万（美）元基因组时代。
如此低廉的单碱基测序成本使得我们可以实施更多物种的基因组计划，从而解密更多生物物种的基因组遗传密码。同时，在已完成基因组序列测定的物种中，对该物种的其他品种进行大规模地全基因组重测序也成为了可能。
下呼吸道感染临床诊治所面临的困境
在2016年全球前十死亡原因统计中，下呼吸道感染位居感染性疾病榜首，导致全球约300万人死亡。目前，感染性疾病的诊治面临多重威胁，从2003年SARS暴发到2016年的寨卡热，新发病原体导致的重大传染病疫情层出不穷。另一方面，临床也面临着肺炎、发热待查、脓毒血症和中枢神经系统感染的病原探查难题，病原难以明确将会造成严重的医疗、经济和社会负担。
2014年英国Jim O’Neill爵士发表的《全球抗菌素耐药回顾》指出：到2050年，抗菌素耐药每年会导致1000万人死亡，可累计造成100万亿美元的经济损失。我国住院的社区获得性肺炎(CAP)患者存在高比例的过度抗感染治疗情况，不充分或过度的经验性治疗均不利于患者的改善预后。
2016年05月21日世界卫生组织曾发出一个呼吁：NO Antibiotics without Test!
目前，临床对各种重症的肺部感染，最大的困境在于：不知道是什么病原的感染？
因此，“经验治疗”、“广覆盖”、“重捶猛击”等概念盛行。造成抗生素的滥用、耐药菌的出现、药占比的增高、住院时间的延长、救治成功率的下降。
所以，快速地明确病原是关键！但现有的传统病原检测方法，大多耗时长，且精度不高。因此，就急需要一种新的病原检测方法，来满足临床的需要！
NGS在呼吸道感染病原诊断中的价值
1.改变世界的感染病例
2014年发表在新英格兰上的一篇个案分析：患儿14岁，联合免疫缺陷综合征男孩，2013年波多黎各旅行回国后诊断“脑膜炎”住院。患儿前后有8个月的反复发热，在住院和门诊期间，进行了38项感染病原检测（6周之内），没有得出诊断，5种抗生素先后联用，患儿依然发热，并出现了神经系统症状（脑积水和偏瘫状态），医生们方采用了mNGS技术：48小时快速测序，采取脑脊液二代测序，检出钩端螺旋体，475条序列，占比0.016%，然后改用青霉素治疗，32天后，男孩痊愈出院。该病例报道后，引起了全世界的轰动！
2.mNGS快速、精准诊断病原体
2016.05月，美国发布FDA NGS感染病诊断指南：NGS标本直接检测：微生物鉴定、抗菌药物耐药性、毒力标志物。
而中国早在2014年，华大基因在科研项目“百万微生物组计划”的研究背景下就开始着力研发NGS用于临床感染性疾病的诊断产品。
目前，华大基因全国范围内已经检测超过25,000个临床样本，大数据总结显示mNGS可以将血流感染和中枢神经系统感染的阳性率提高3-4倍。现阶段的mNGS处于临床应用的初始阶段，改进和提升空间巨大，未来感染精准诊断行业前景广阔。
mNGS的特点：快速、精准！从样本接收到进化分析的交付周期只有24h，可快速地进行病原菌的全基因组测序和各病例菌株之间的进化分析。
mNGS半定量检测对于评估疾病的治疗效果有重要的指导作用，在血流感染、免疫低下患者、重症肺炎和局灶感染中都具有较好的应用价值，能够帮助临床确诊较困难的感染性疾病，在不常见病原发现中较传统培养具有优势。
介入呼吸病学技术联合NGS在呼吸道感染病原诊断中的价值
1.介入呼吸病学技术在下呼吸道感染取材方面的独特优势
不仅可以取到下呼吸道内的分泌物，还可以取BALF。同时，还可以在导航、EBUS的引导下，取病变部位的肺组织送NGS，这在一定程度上能够很好地解决有关cutoff值的问题。
2.取材方法的比较：
3.定植菌or感染菌？
临床上传统取材的报告单即使看了，医生们也不能明确具体哪个是病原体（定植菌or感染菌？），更体现了NGS在呼吸道感染病原诊断中的决定性作用。
未来将介入呼吸病学技术与mNGS有机的结合，将会为临床疑难和危重的下呼吸道感染的诊断和救治提供重要的技术支撑。
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