廖楚舒1， 范莎莎1， 邓中华2， 曹友德2
（1.湖南省人民医院血液科，湖南 长沙 410005；2. 湖南省人民医院检验科，湖南 长沙 410005）
摘要：目的探讨血清凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）﹑血管内皮生长因子（VEGF）水平与原发性肝癌（PHC）进展的关系，评价2项指标对PHC早期诊断的价值。方法收集PHC患者88例，其中Ⅰ期20例﹑Ⅱ期25例﹑Ⅲ期43例，另收集正常对照组40名。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清TSP-1﹑VEGF水平，应用电化学发光法测定血清甲胎蛋白（AFP）水平。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估TSP-1﹑VEGF及AFP对PHC的诊断效能。结果PHC组Ⅰ﹑Ⅱ﹑Ⅲ期患者血清TSP-1水平均低于正常对照组（P＜0.05），PHC组Ⅲ期患者血清TSP-1水平低于PHC组Ⅰ和Ⅱ期患者（P＜0.05），但PHC组Ⅰ﹑Ⅱ期患者之间血清TPS-1水平差异无统计学意义（P＞0.05）。PHC组Ⅲ期患者血清VEGF水平与正常对照组﹑PHC组Ⅰ期患者﹑PHC组Ⅱ期患者之间差异有统计学意义（P＜0.05）。ROC曲线分析显示，血清TSP-1﹑AFP﹑VEGF诊断PHC的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.893（P＜0.05）﹑0.712（P＜0.05）﹑0.568（P＞0.05），诊断早期PHC的AUC分别为0.883（P＜0.05）﹑0.821（P＜0.05）﹑0.539（P＞0.05）。结论PHC患者血清TSP-1水平随着PHC的进展逐渐降低，而VEGF水平逐渐增高。TSP-1对PHC及早期PHC具有诊断价值，TSP-1对PHC的诊断效能较AFP强。VEGF对PHC及早期PHC的诊断价值非常有限。
关键词：凝血酶敏感蛋白1；血管内皮生长因子；原发性肝癌
原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是世界上常见的十大恶性肿瘤之一。近年来在肝癌治疗方面已有较大进展，但PHC早期较为隐匿，临床确诊时多已为中﹑晚期，治疗效果欠佳，早期发现PHC并及时治疗可大大提高患者的5年生存率[1-2]。因此，PHC的早发现﹑早诊断﹑早治疗显得尤为重要。目前，临床用于PHC诊断的血清标志物主要是甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），但由于某些PHC患者癌细胞不分泌AFP，检测有时亦可阴性，所以仅凭AFP诊断肝细胞肝癌很容易造成漏诊或误诊[3]。我们旨在探讨凝血酶敏感蛋白1（thrombospondin 1，TSP-1）﹑血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）血清水平与PHC进展的关系，并评价2项指标对PHC早期诊断的价值。
1.1 研究对象
选取2013年1月—2014年3月湖南省人民医院住院确诊的PHC患者88例，其中男53例﹑女35例，年龄（57.8±15.0）岁，按照PHC中国分期标准[4]，将88例PHC患者分为3期：Ⅰ期20例﹑Ⅱ期25例﹑Ⅲ期43例。正常对照组为肝功能及肝脏B超检查显示正常的体检者40名，其中男23名﹑女17名，年龄（45.8±14.3）岁。各组间年龄﹑性别差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2 方法
1.2.1 样本采集 所有对象均于清晨空腹，自肘正中静脉抽取静脉血3～4 mL，以800×g离心15 min分离血清，以120 μL分装于Eppendorf管中，置于-70 ℃保存待检。
1.2.2 TSP-1﹑VEGF的检测 血清TSP-1和VEGF的检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），试剂盒均购自Cusabio公司。检测严格按照试剂盒说明书进行。
1.2.3 AFP的检测 取10 μL血清样本，采用Cobas e601电化学发光全自动免疫分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂（电化学发光法）测定血清AFP水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计分析。符合正态分布的定量数据采用
2.1 PHC组与正常对照组血清TSP-1和VEGF水平的比较
PHC组血清TSP-1水平明显低于正常对照组（P＜0.05），血清VEGF水平明显高于正常对照组（P＜0.05）。见表1。
表1 PHC组与正常对照组血清TSP-1和VEG水平的比较（
组别 例数 TSP-1（μg/mL） VEGF（pg/mL）PHC组 88 65.92±31.92 173.64±158.20正常对照组 40 200.11±106.40 73.70±38.22 t值 10.69 2.11 P值 ＜0.05 ＜0.05
2.2 血清TSP-1及VEGF水平在正常对照组和PHC组各期患者中的变化
PHC组Ⅰ﹑Ⅱ﹑Ⅲ期患者血清TSP-1水平均低于正常对照组（P＜0.05），PHC组Ⅲ期患者血清TSP-1水平低于PHC组Ⅰ和Ⅱ期患者（P＜0.05），但PHC组Ⅰ﹑Ⅱ期患者之间血清TSP-1水平差异无统计学意义（P＞0.05）。正常对照组﹑PHC组Ⅰ期﹑PHC组Ⅱ期间血清VEGF水平差异无统计学意义（P＞0.05），但PHC组Ⅲ期患者血清VEGF水平高于正常对照组﹑PHC组Ⅰ期患者﹑PHC组Ⅱ期患者（P ＜0.05）。见表2。
表2 各组血清TSP-1和VEGF水平的比较（
注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与PHC组Ⅰ期比较，#P＜0.05；与PHC组Ⅱ期比较，△P＜0.05
组别 例数 TSP-1（μg/mL） VEGF（pg/mL）正常对照组 40 200.11±106.40 73.70±38.22 PHC组Ⅰ期 20 101.60±25.62* 92.65±62.28Ⅱ期 25 77.87±22.62* 106.39±78.45Ⅲ期 43 42.37±16.50*#△ 247.44±201.56*#△
2.3 TSP-1﹑VEGF﹑AFP对PHC的诊断效能评价
ROC曲线分析显示，血清TSP-1﹑VEGF及AFP诊断PHC的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）[95%可信区间（confidence interval，CI）]分别为0.893（0.813～0.954）（P＜0.05），AFP 0.712（0.711～0.912）（P＜0.05），VEGF 0.568（0.466～0.671）（P＞0.05）。
图1 TSP-1﹑VEGF和AFP诊断PHC的ROC曲线
2.4 TSP-1﹑VEGF﹑AFP对早期PHC诊断效能的评估
ROC曲线分析显示，TSP-1﹑VEGF和AFP诊断早期PHC（Ⅰ期）的AUC（95%CI）分别为0.883（0.735～0.935）（P＜0.05）﹑0.821（0.629～0.906）（P＜0.05）﹑0.539（0.374～0.704）（P＞0.05）。见图2。以ROC曲线上约登指数最大值时的指标水平为截断点，TSP-1的临界值为132.11 μg/mL，敏感性为95.0%，特异性为70.0%；AFP的临界值为19.15 ng/mL，敏感性为85.0%，特异性为75.0%。见表3。
图2 TSP-1﹑VEGF和AFP诊断早期PHC的R OC曲线
表3 TSP-1﹑AFP诊断早期PHC的敏感性﹑特异性及约登指数
指标 敏感性（%） 特异性（%） 约登指数TSP-1 95.0 70.0 0.650 AFP 85.0 75.0 0.600
PHC是恶性程度高﹑危害大的恶性肿瘤，PHC患者就诊时多数已属中﹑晚期，治疗效果不理想。因此，PHC的早期诊断﹑正确诊断对提高患者的5年生存率以及改善生存质量至关重要[5]。
TSP-1是一种重要的细胞外基质糖蛋白，能够调控内皮细胞的黏附﹑运动和增殖，是一种有效的内源性血管生成抑制因子，在肿瘤的生长﹑迁移﹑降解细胞外基质和血管生成方面起重要作用[6-7]，可抑制肿瘤血管生成。而肿瘤新生血管生成对实体瘤的生物学行为和转移潜能起重要作用，抑制肿瘤的血管生成可阻止肿瘤的生长﹑转移[8]。现已发现多种肿瘤患者TSP-1水平降低，肿瘤的恶性程度及转移率高，患者预后较差[7]，但PHC患者血清TSP-1水平国内还少有报道，特别是其对早期PHC诊断价值的研究国内外鲜有报道。
VEGF是一种相对分子质量为34 000～42 000的糖蛋白，由某些肿瘤细胞分泌，可与血管内皮细胞上的受体结合，诱导血管生成并维持肿瘤的继续生长[9]。
新近国内研究表明，在包括PHC在内的多种肿瘤组织中TSP-1水平越低﹑VEGF水平越高，肿瘤的微血管密度（microvessel density，MVD）越高，肿瘤侵袭性越强[10-12]，这充分证明了TSP-1作为血管生成抑制因子﹑VEGF 作为血管生成促进因子在肿瘤的形成和发展中发挥着重要作用。文卫等[13]在TSP-1﹑VEGF与肝癌患者术后复发﹑转移的关系方面也做了深入研究，其研究结果显示TSP-1 是重要的血管生成抑制因子，在一定程度上可以限制肝癌的复发和转移；VEGF是重要的血管生成促进因子，在肝癌的复发和转移中起重要的促进作用。但对PHC患者血清学这2项指标的研究较少，尤其是对于早期PHC的诊断价值少有报道。
本研究对PHC患者血清TSP-1和VEGF水平进行分析，结果显示：随着PHC的进展，TSP-1血清水平逐渐降低，支持TSP-1在肿瘤新生血管形成过程是作为抑制因子发挥作用的这一观点；随着PHC的进展，VEGF血清水平逐渐升高，说明VEGF在肿瘤新生血管形成过程是作为促进因子发挥作用的。值得重视的是，本研究发现早﹑中期PHC患者TSP-1水平即与正常对照组有明显差异，提示TSP-1有可能成为PHC早期诊断的肿瘤标志物。对PHC组和正常对照组血清TSP-1﹑VEGF及AFP水平进行ROC曲线分析，以评价各指标对PHC的诊断效能。结果显示TSP-1及AFP的AUC分别为0.893和0.712（P＜0.05），而VEGF的AUC为0.568（P＞0.05），说明TSP-1及AFP作为PHC血清标志物具有统计学意义，而VEGF则没有统计学意义，TSP-1的AUC比AFP大，说明TSP-1比AFP的诊断效能更高。另外，对早期PHC患者TSP-1﹑VEGF及AFP进行ROC曲线诊断效能分析。结果显示，TSP-1和AFP作为标志物诊断早期PHC均有统计学意义，而VEGF作为早期诊断标志物则无统计学意义。TSP-1与AFP的AUC分别为0.883和0.821，TSP-1的AUC大于AFP，说明TSP-1对早期PHC的诊断价值优于AFP。选择曲线上约登指数最大值时的指标水平为截断点，TSP-1的临界值为132.11 μg/mL，敏感性为95.0%，特异性为70.0 %，AFP的临界值为19.15 ng/mL，敏感性为85.0%，特异性为75.0%。TSP-1的敏感性明显比AFP高，而特异性却较AFP低，这一结果为将来在临床上采用大样本验证TSP-1作为早期诊断PHC血清标志物的可能性提供了研究基础和假设。但由于TSP-1与许多肿瘤都有关系，若作为PHC的辅助诊断指标会不会存在特异性较差的问题，具体情况还有待进一步研究。
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Relationships of serum TSP-1 and VEGF levels with primary hepatic carcinoma
LIAO Chushu1，FAN Shasha1，DENG Zhonghua2，CAO Youde2.
（1. Department of Hematology，Hunan Provincial People's Hospital，Changsha 410005，Hunan，China；2. Department of Clinical Laboratory，Hunan Provincial People's Hospital，Changsha 410005，Hunan，China）
Abstract：ObjectiveTo investigate the relationships of serum thrombospondin 1（TSP-1）and vascular endothelial growth factor（VEGF） levels with the progression of primary hepatic carcinoma（PHC），and to evaluate the 2 indicators for the early diagnosis of PHC.MethodsA total of 88 PHC patients were enrolled，including 20 cases of Period Ⅰ，25 cases of Period Ⅱ and 43 cases of Period Ⅲ. A total of 40 healthy subjects were enrolled. Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to determine the levels of serum TSP-1 and VEGF. Electro-chemiluminescence was used to determine the levels of alpha-fetoprotein（AFP）. Receiver operating characteristic（ROC） curves were used to evaluate the diagnosis ef fi ciency of TSP-1，VEGF and AFP.Results Serum TSP-1 levels of Period Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ in PHC group were higher than that in healthy control group（P＜0.05）. Serum TSP-1 level of Period Ⅲ was lower than those of Period Ⅰ and Ⅱ（P＜0.05）. Serum TSP-1 levels had no statistical significance between Period Ⅰ and Ⅱ（P＞0.05）. There was statistical significance for serum VEGF of Period Ⅲ in PHC group with healthy control，Period Ⅰ and Period Ⅱ groups（P＜0.05）. ROC curve showed that the areas under the curves（AUC） were 0.893 for TSP-1（P＜0.05），0.712 for AFP（P＜0.05）and 0.568 for VEGF（P＞0.05） in the diagnosis of PHC. AUC were 0.883 for TSP-1（P＜0.05），0.821 for AFP（P＜0.05） and 0.539 for VEGF（P＞0.05） in the early diagnosis of PHC.ConclusionsThe levels of TSP-1 decrease with the progression of PHC，and the levels of VEGF gradually increase. The diagnosis ef fi ciency of TSP-1 is better than that of AFP，and that of VEGF is limited.
Key words：Thrombospondin 1；Vascular endothelial growth factor；Primary hepatic carcinoma
文章编号：1673-8640（2017）02-0104-04
中图分类号：：R446.62
文献标志码：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.02.008
（收稿日期：2016-03-27）
（本文编辑：姜 敏）
基金项目：湖南省卫生厅科技项目（B2014-082）
作者简介：廖楚舒，女，1989年生，硕士，技师，主要从事肿瘤标志物的相关研究。
通信作者：曹友德，联系电话：0731-83928216。
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