微卫星不稳定性（MSI）在结直肠癌诊断及预后中的应用

1 微卫星（microsatellites）不稳定性

微卫星（microsatellites）又称简单重复序列，是存在于基因组中的一些小片段核苷酸的重复序列，重复单位一般由1~6个核苷酸组成，重复次数不超过60次，具有高突变性。DNA 在复制过程中，尤其是微卫星，可能会出现碱基错配等错误，这些错误累积起来并一代代的传递下去，最终会产生基因突变进而导致细胞癌变。这种在DNA复制过程中产生的一些简单重复序列的插入或缺失，被称为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）[1]。

2 MSI与错配修复（MMR）蛋白间的关系

DNA错配修复（Mismath repair, MMR）系统由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子(MMR蛋白）组成。MMR蛋白的主要功能是修复DNA复制过程中产生的错配，包括单碱基错配和2个以上的插入/缺失错配，从而保持遗传物质的完整性和稳定性，避免遗传物质发生突变。据目前报道：涉及人类DNA错配修复的MMR蛋白主要有5个，其编码基因分别为MLH1、 PMS1 、PMS2、MSH2和 MSH6。MMR系统会对在DNA复制过程中的碱基错配等错误进行纠正，一旦修复系统失效，基因突变的风险便会提高。因此，MMR基因突变后， DNA复制时的过程中便会发生MSI[2, 3]。

3 MSI判定标准

MSI的检测方法很多。目前较常使用的检测技术为聚合酶链反应（PCR）和免疫组化（IHC）检测[4]。

PCR检测，目前公认的标志物套餐由BAT25、BAT26、NR21、NR24、NR22或NR27组成。当检测的微卫星标志物中没有发现异常，标本定义为微卫星稳定性（MSS）；如果有一个标志物或低于40%的标志物显示异常，则标本被认定为低水平微卫星不稳定性(MSI-L)；当测试标志物的40%或超过40%异常时，标本被认定为高水平微卫星不稳定性（MSI-H）。

免疫组化检测，建议使用PMS2、MSH6、MLH1和MSH2的抗体套餐来检测MSI现象。判读标准如下：在对照组织（即肿瘤周围的正常上皮细胞、肿瘤内浸润的淋巴细胞、间质细胞均出现细胞核着色）中----强阳性表达的前提下，只要MMR蛋白在肿瘤细胞出现核着色（ ），即判定该蛋白为阳性表达；若MMR蛋白在肿瘤细胞未出现核着色现象（—）则视为MMR蛋白缺失[5, 6]。当四个错配修复蛋白均表达时，可判定为MSS；当四个错配修复蛋白中只有一个发生表达缺失时，可判定为MSI-L；当四个错配修复蛋白2个或以上表达缺失时，可判定为MSI-H。已确定4种MMR蛋白对MSI-H的敏感性、特异性均接近100%。

4 林奇综合征（Lynch综合征）的发病机制和临床特征

林奇综合征是指因错配修复基因（MMR）突变而易患结直肠癌和其他恶性肿瘤的一种常染色体显性遗传性疾病，占结直肠癌的2%~5%。该综合征曾被命名为遗传性非腺瘤性结直肠癌（HNPCC），后因该命忽略了肠外肿瘤的高发率而弃用。已知MLH1、MSH2、MSH6和PMS2这四种MMR基因与林奇综合征的发生密切相关。大多数林奇综合征家（85%~90%）检测到的是MLH1和MSH2突变，剩余的10%~15%的家族存在MSH6的突变，少数存在PMS2的突变[7]。同时，已有研究表明：绝大多数林奇综合征都具有高水平微卫星不稳定性（MSI-H）的现象[8]。

林奇综合征发病年龄较早，平均年龄为45岁，明显低于正常人群发生结直肠癌的平均年龄（60岁）。林奇综合征患者的结肠癌好发于近端结肠，70%～85%的肿瘤位于结肠脾区附近。这些肿瘤具有特异的组织病理学特征，比如髓样生长的癌、粘液腺癌或肿瘤区过多的淋巴细胞浸润。林奇综合征患者在其一生中易发生多处原发肿瘤，据统计有54%～61%的林奇综合征患者会发生第二种原发肿瘤，更有甚者，部分患者会发生三种或更多的原发肿瘤[7]。这些肿瘤包括有子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、尿路肿瘤、肝胆肿瘤、胰腺癌等。因此，当确诊的林奇综合征患者在发现第一处结直肠癌时就会被建议进行更大的结肠次全切除术或全切术。

5 MSI在结直肠癌诊断及预后中的应用

5.1 MSI在林奇综合征中筛查诊断中的应用

由于如Amsterdam标准、Bethesda标准等鉴定标准对林奇综合征诊断缺乏稳定性和敏感性[9]，目前公认的最准确、可靠地诊断林奇综合征的方法是MMR基因测序。又因MMR基因测序的费用昂贵，因此在进行基因测序前先进行初步筛查。目前较为公认的林奇综合征相关的初步筛查检测包括聚合酶链反应（PCR）和免疫组化（IHC）。

当样本确定为MSS时，患者不可能患林奇综合征；当样本确定为MSI-L时，绝大部分患者不可能患林奇综合征；当样本确定为MSI-H时，患者患有林奇综合征的可能性极高，需进一步进行林奇综合征的筛查诊断。

聚合酶链反应（PCR）：PCR的结果判读本文不做讨论。

IHC检测注意事项：

（1）可能会出现MMR蛋白在肿瘤细胞核着色不完整或着色极微弱（并伴随细胞质着色）现象，有文献指出该现象可能是MMR基因突变（如错义突变）或MMR蛋白特点（该现象常见于MSH6蛋白）而造成的，建议进行PCR检测。

（2）大约有12.5%的散发性结直肠癌患者其IHC检测MLH1蛋白表达缺失。这种缺失同遗传性无关，是MLH1启动子双等位基因的异常甲基化而造成的，为避免误诊，需加做BRAF V600E突变检测。若检测结果为阳性，可排除Lynch综合征[10]。

（3）当样本为MSH6或PMS2蛋白缺失的MSI-L时，可能是Lynch综合征的罕见表型，建议进一步确诊。由于所有MMR蛋白的核染容易识别，且周围间质组织就可作为内对照；同时IHC检测具有操作简单、价格便宜和可以迅速拿到检测结果等优点，所以目前IHC检测已经替代PCR检测成为林奇综合征的初步筛选方法，或在PCR检测之后找出缺失的MMR蛋白。

5.2 MSI对结直肠癌化疗和预后的预测意义

结直肠癌的化疗而言，有大量的研究表明MSI状态对于决定结直肠癌患者是使用5-FU治疗还是伊立替康治疗很重要。一项林奇综合征患者长期随访的回顾性研究，根据MSI状态进行评价，证实5-FU 辅助治疗可使MSI-L和MSS患者生存得到改善。然而，在MSI-H患者术后5-FU辅助治疗并没有显示出有统计学意义的效果，相反5年生存率低于那些仅接受手术治疗的患者[11]。同时，MSI患者比起MSS患者对伊立替康的治疗更为敏感。根据上文所述，MSI的发生，与MMR基因缺失有关，因此NCCN结直肠癌小组建议计划单独使用5-FU进行辅助治疗的Ⅱ期结直肠癌患者需进行MSI检测。

结直肠癌的预后而言，一项汇集32项研究的荟萃分析表明：MSI患者生存期更长、病死率更低(不易发生肿瘤复发及淋巴结转移)[12]。

鉴于MMR基因在结直肠癌治疗和预后方面的显著影响，美国中心的结直肠癌基因组学预防与应用工作组（EGAPP）建议所有新诊断的结直肠癌患者均应通过IHC检测筛查MMR蛋白缺失或进行PCR检测以用于预测患者预后情况和确定哪些患者应进行林奇综合征的基因检测[13]。

参考文献

[1]Boland CR, Goel A. Microsatellite instability in colorectal cancer[J]. Gastroenterology, 2010, 138(6):2073-2087 e3.

[2]Jiricny J. The multifaceted mismatch-repair system[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006, 7(5):335-46.

[3]Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon[J]. Science, 1993, 260(5109):816-9.

[4]McConechy MK, Talhouk A, Li-Chang HH, et al. Detection of DNA mismatch repair (MMR) deficiencies by immunohistochemistry can effectively diagnose the microsatellite instability (MSI) phenotype in endometrial carcinomas[J]. Gynecol Oncol, 2015, 137(2):306-10.

[5]Garg K, Leitao MM, Jr., Kauff ND, et al. Selection of endometrial carcinomas for DNA mismatch repair protein immunohistochemistry using patient age and tumor morphology enhances detection of mismatch repair abnormalities[J]. Am J Surg Pathol, 2009, 33(6):925-33.

[6]South CD, Yearsley M, Martin E, et al. Immunohistochemistry staining for the mismatch repair proteins in the clinical care of patients with colorectal cancer[J]. Genet Med, 2009, 11(11):812-7.

[7]Walsh MD, Cummings MC, Buchanan DD, et al. Molecular, pathologic, and clinical features of early-onset endometrial cancer: identifying presumptive Lynch syndrome patients[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(6):1692-700.

[8]Pawlik TM, Raut CP, Rodriguez-Bigas MA. Colorectal carcinogenesis: MSI-H versus MSI-L[J]. Dis Markers, 2004, 20(4-5):199-206.

[9]Palomaki GE, McClain MR, Melillo S, et al. EGAPP supplementary evidence review: DNA testing strategies aimed at reducing morbidity and mortality from Lynch syndrome[J]. Genet Med, 2009, 11(1):42-65.

[10]Capel E, Flejou JF, Hamelin R. Assessment of MLH1 promoter methylation in relation to gene expression requires specific analysis[J]. Oncogene, 2007, 26(54):7596-600.

[11]Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, et al. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer[J]. N Engl J Med, 2003, 349(3):247-57.

[12]Hutchins G, Southward K, Handley K, et al. Value of mismatch repair, KRAS, and BRAF mutations in predicting recurrence and benefits from chemotherapy in colorectal cancer[J]. J Clin Oncol, 2011, 29(10):1261-70.

[13]Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention (EGAPP) Working Group. Recommendations from the EGAPP Working Group : genetic testing strategies in newly diagnosed individuals with colorectal cancer aimed at reducing morbidity and mortality from Lynch syndrome in relatives [J] . Genet Med , 2009,11(1):35-41.

温馨提示

本文作者：福建省立医院病理科主任 陈小岩