来源：生物秀
免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的。因此，为了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净
组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无皱折
应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无皱折，这样有利于染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有皱折，免疫组化染色后，在皱折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引起混淆。
四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyltriethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原
应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，对切片的质量要求很高，尤其是切片的附贴程度。切片究竟烘烤多长时间才合适，既不脱片和适合各项要求，又不至于破坏抗原。几组实验诊断P173认为，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。这是因为：抗原可耐受如此的温度，病理科一般使用的石蜡，其熔点在60℃左右，组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度，一般都调在65℃左右，组织在这样温度中要浸泡2小时以上，才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65℃的温度考验，保存下来的抗原，都已具有耐热性。另外，经上述时间烘烤出来的切片，附贴牢固，抗原保存好，染色成功率达100%，保证了病理诊断的及时性和准确性。
六、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果
蜡不溶于水，不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂，处理足够的时间，才能将其除去。如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起许多弊病，如染色不均匀，阳性物时隐时现，真假难辨，背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节：如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够；如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底，干净，完全地脱去切片上的蜡。为了做到这一步，切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。
七、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色
在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶，尤其在红细胞，中性粒细胞，单核细胞嗜酸性细胞，出血的组织、坏死的组织等等。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在DAB底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，使之生成与阳性物一样的黄棕色，造成混乱。为止，在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。当然，对它们进行彻底的消除是不行的，因为抑制太厉害，对抗原也会有相同的抑制作用。氢在抑制内源性过氧化物酶时，也要注意对抗原的保护抑制也只能对它们中的大部分在DAB显色后，显示出淡黄色，这就足以与真正阳性物的区别。抑制剂常用的是0.3%的H2O2，也可将其称为1%H2O2，因为市售的H2O2的浓度为30%，按其净含量则为0.3%，如果按其溶液的用量则为1%。
八、须适当合理地使用封闭试剂
为了减少背景产生的非特异性染色，在免疫组化染色的过程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，陈尚季等认为：抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合（如胶原）。由于这种非特异性结合，将导致标记的部分局部化（轭合物）和胶原的假阳性染色。要用一种不相干的抗体优先处理，可能减少和标记的抗体无特异性结合。
九、选择合适的抗体
（一）至今为止，应用于临床的常用抗体有几十种，在这当中又可分为两种类型：
1、浓缩型抗体
根据近几年来使用的情况认为，它有许多优点，但也有许多不足之处：
（1）可作为各种疾病检测的常备抗体；
（2）成本低，价格较便宜；
（3）需要稀释抗体，手续较为复杂；
（4）需要配置各型号的微量加样器，以利于量取精确的抗体量；
（5）需要具备一定的英语水平，因为浓缩型的抗体多为进口试剂，其使用书都以英文为主，其中涉入抗体的来源，适应让稀释对什么组织或细胞可起反应等。
2、即用型抗体
近几年来，免疫组化技术应用的推广，即用型抗体的应用越来越受到人们的欢迎，根据几年来的使用，认为它有许多优点和不足：
（1）使用方便；
（2）对于不具备或基本不懂免疫组化技术的人，只要按照说明书的方法使用，也能获得理想的结果；
（3）不需要配置多种昂贵的微量加样器；
（4）特别适合于基层单位；
（5）价格较浓缩型抗体贵；
（6）即用型抗体不可作为常备贮存抗体。
（二）抗体的适应症
在众多的抗体中，按它们的实际使用范围，把它们分为两个类：
1、适合于冰冻切片，涂片，细胞培养片。
2、适合于石蜡切片，冰冻切片，涂片和细胞培养片。
（三）选择合适的单克隆或多克隆抗体
抗体除了分为上述的两个分类外，从其克隆的高度讲，也有单克隆和多克隆之分：
1、单克隆抗体，在目前临床常用的抗体当中，大部分都是单克隆抗体。
2、多克隆抗体，在临床应用的抗体中，还有少部分的抗体为多克隆抗体。
（四）抗体的加入
这看似很简单的问题，如果处理不好也可导致不同的结果，如果应用自动免疫组织化学染色仪，将程序输入即可，如为手工操作，就必须注意以下的问题：
1、当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，二抗或三抗。
2、加入的抗体以一滴为佳。
3、切片没擦好将会影响加入抗体的质量，切片没冲洗干净，没擦试好，当加入抗体后，它可缩于切片的一边。
（五）选择合适的孵育时间
第一抗体的孵育时间，有较多的使用范围，应用于临床检测抗体的孵育时间。一般室温下孵育在30-60分钟，120分钟，对于研究性质的抗体孵育时间，也可按照上述的时间，但也有人提出于4℃冰箱中过夜孵育，根据我们的经验一般不主张于4℃冰箱中过夜，原因是：
1、长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来，或者被吸附，造成背景的染色。
2、目前销售的抗体，纯度较高，特异性较强，不需要长时间的孵育，也能够结合得很好。
3、长时间的孵育，较容易引起切片的脱落，造成染色的失败。
4、长时间的孵育，不利于临床病理报告的发出。
十、连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴性的现象
免疫组化染色方法较多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，这时就必须要仔细地选择好连接抗体，第一抗体有单克和多克隆之分，连接抗体则要根据选用的抗体来进行。
十一、复合物的使用及孵育时间的确定
各种方法有各自的复合物，如ABC法，复合物是卵白素和生物素结合的复合物，再带有HRP，SP法，（LsAB法）的复合物是链雪菌素蛋白复合物，再带有HRP，EV二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物，再带上HRP，除此之外，根据水解底物的不同，可产生不同的颜色。
十二、PBS的冲洗
免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入的抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。
（一）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
（二）温柔冲洗，防止切片的脱落。
（三）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
（四）PBS的PH和离子强度的使用和要求。
（五）常用试剂的配制和使用。
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