二代测序在临床应用需要注意什么？
“美国纽约东北部的撒拉纳克湖畔，镌刻着西方一位医生特鲁多的铭言：有时去治愈，常常去帮助，总是去安慰。
而中国医生的墓志铭是什么呢：
初从文，三年不中
后习武，校场发矢
中鼓吏，逐之出
遂学医，有所成
自撰一良方，服之，卒
两个段子，是过去中西方医生截然不同的理念，而现在医学理念也越来越融贯中西。这是施毅教授近日在2019年中华医学会呼吸病学年会暨第二十次全国呼吸病学学术会议上精彩演讲的开篇，本次会议在江城武汉举行，汇聚了全国各地呼吸病学专家，为大家带来学术盛宴。而施教授一席有趣生动又“有料”的演讲更是赢得观众的喝彩，我们一起来看看吧！
01
老龄化社会带来严峻的感染现状
随着时代的变化，我们的社会也正在步入老龄化，过去我们对老人的标准是大于等于60岁，现在是大于等于65岁。而随着老龄化社会的变迁，变化的还有疾病谱。拿日本为例，日本老龄化带来的是老年人肺炎死亡率急速增加的后果，而在欧美国家，老年人死亡率第一的疾病是心脑血管疾病。那么感染性疾病的现状如何呢？
全球：
据WHO报道，感染性疾病导致患者死亡全部死因的25%以上，每年1300万儿童死于感染性疾病。
中国：
感染性疾病占所有疾病的50%以上，造血系统肿瘤患者75%死于感染，实体肿瘤患者50%死于感染。
感染性疾病是人类头号杀手，是导致儿童死亡第一位的原因。抗生素的使用，使疾病得以控制，也使病原产生耐药性，甚至形成超级细菌。
在感染性疾病诊断中，诊断、治疗和预防是三个关键环节。然而众多危重感染无法准确诊断，例如：30%-50%的肺炎致病原因不明， 40%-60%的关节炎致病原因不明。
感染性疾病也给患者带来沉重的疾病负担，那么在如此严峻的现状下，有两个问题摆在临床医生面前：能确认是感染吗？能找到病原体吗？问题摆在眼前，促进感染性疾病的诊疗也成了众多专家努力的方向，宏基因组二代测序（mNGS）应运而生。
02
什么是宏基因组二代测序
所谓宏基因组二代测序，是不基于培养，直接从环境/临床样品中提取全部微生物的DNA，利用基因组学的研究策略研究环境样品中所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能，可广泛分析临床样本微生物组（细菌、真菌、病毒）的高通量测序方法。
传统的检测方法在敏感性，特异性，时效性，信息量等方面存在局限，而且对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。而mNGS从取样，核酸提取及建库到测序、生信分析及报告，整个过程约24小时。
目前该技术已经纳入的病原体有8000多种，其中包括3000余种细菌，4000余种病毒，200 余种真菌和140种寄生虫，为疑难危重症及罕见病原微生物感染的诊断提供了有效的技术手段。
2014年，mNGS走入大众视野，新英格兰医学杂志（NEJM）刊登了一则病例：
14岁联合免疫缺陷综合征男孩，2013年波多黎各旅行回国后因脑膜炎住院，发展为脑积水和癫痫状态。6周内进行38项感染病原检测，先后联用5种抗菌药物，未查出病因，尝试按照自免脑引起的昏迷状态治疗。48小时脑脊液宏基因组测序，检出圣地罗西钩端螺旋体序列475条，改用青霉素治疗，32天后男孩痊愈出院。
NEJM主编评论该报告的标题为“NGS，一个病例如何改变世界”，可见NGS的重要意义。
随后，mNGS迅速被临床认可，2016年美国FDA NGS感染性疾病诊断策略提出，mNGS可以用于微生物鉴定，检测是否耐药，是否是毒力标志物。
目前，病原体高通量测序的临床适应症包括：
疑难：不明原因感染诊断，病因排查；
危重：重症肺炎、脑膜炎、脓毒症等；
特殊：免疫低下人群，如移植患者、肿瘤患者等。
mNGS的技术正随着社会的发展，在不断进步、完善。
可适用的感染类型和可送检的标本（图）
03
正确认识mNGS技术的局限和挑战
与传统病原微生物检测相比，mNGS 敏感性高，信息量大，但也存在一定的局限性。因此，施教授也通过几个问题，为大家带来新的认识。
检出的病原体：
检出的病原体只能代表标本中存在这些检出微生物，但不能确定是定植菌、背景菌还是致病菌。
胞内菌/真菌检出率低：
胞内感染菌因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低。另外，具有较厚细胞壁的病原体，其核酸提取效率较低，导致检出率和敏感性较低。
RNA病原体的检测：
RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测还存在一定的困难。
可靠程度：
不同的公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度、覆盖度、丰度、估测浓度、置信度，各有千秋，需要统一。
最重要的参数需谨记：病原体，序列数。
reads指的是匹配到该病原体的序列数目，reads高不一定意味着致病，reads数低不一定意味着不致病，数的多少与标本中病原体含量多少、标本中核酸提取量及标本中人源序列比例有关。
不同的病原体，具有不同的reads数特点，单个病原体逐个分析至关重要。结合reads数目、病原体排位，临床才能更好的进行分析。
老年男性，因“流感”1周入住呼吸ICU，PCR确诊重症甲流肺炎，治疗好转，第5天再次发热，病情加重，考虑继发曲霉感染，经验性抗曲霉治疗。诊断是否成立？经验性治疗合理吗？
检查GM试验，血清GM 3.81，BALF GM4.34，高度拟诊，但所有标本培养无真菌生长。此时BALF mNGS结果汇报，检测到烟曲霉，诊断成立，继续治疗痊愈。
因此，mNGS报告时要注意以下三个要点：是否是致病病原体或条件致病病原体；人体正常存在微生物，在免疫缺陷等特殊患者中值得关注；由检测试剂和序列对比噪音引入的微生物不应出现在报告中。
检出的病原体：
报告只能给出病原体，是定植菌、背景菌还是致病菌，需要结合临床。
有无临床感染证据：
有无发热、感染的症状、体征。
实验室检查：
结合患者的血象、血沉、CRP、PCT、IL-6、镜检结果、培养结果、血清学检查。
结合影像学改变：
影像学改变是感染的重要证据。
检测方法：
mNGS技术的方法。
不结合临床，NGS报告就是废纸一张。
检测阳性≠致病病因。
多病原体列表展示的优势作用在于提供可能的有效线索；
开发特征基因数据库和大样本背景菌数据积累，将会进一步明确检出病原与疾病的关联性。
阴性报告也并非全无价值。
治疗前：结合病人情况排除感染或病原体本身含量很低；
治疗后：用药后取样导致病原体含量降低。
严格致病病原体：
如结核、奴卡菌、流感病毒、曲霉、支原体等，可考虑为致病病原。
条件致病菌：
铜绿、鲍曼、肺克、链球菌等，要看测到的序列数，以及排名，结合临床来判断。
多重病原体混合感染：
多病原感染，或呼吸道分泌物、肠道分泌物开放体系本身的微生物多样性等原因会导致多种病原体检出，这更需要结合临床进行分析。
常见呼吸道定植菌：
一般不考虑致病性，除非序列数特别高。
罕见、特殊病原体：
检索文献，具体分析。
有些样本培养、核酸检测阳性，而mNGS却什么都没有检测出来，技术不行？
卫生经济成本：
经济成本与灵敏度的权衡。当病原体感染后含量很低或用药后病原数量降低，在数据量限定的情况下，靶病原由于信息太少而被丢失。
人源和背景序列的干扰：
人源基因序列巨大的信息量使原本量少的病原难以检测到，国内人源基因序列大于95%，国外已经低于60%。
报告的取舍：
公司各自设定的报告序列底线（如3个序列）、种类、背景（背景菌另列）等。
标本的错误：
DNA提取不当，处理不当，运输不当。
看到上图，你第一眼是否看成是”一个坐着的小人“，但换种角度看，它其实是-4°。会上，施教授通过这一张简单的图片，告诉我们“看待事物的角度不同，结论就不同”。临床任何事情也是一样，需要全方面考虑，平衡得失，选出最优的方案。
mNGS 具有比传统病原微生物检测技术更强大的效能，但目前在应用方面还存在一些需要改进的地方，不能完全取代常规的检测技术，未来的感染性疾病诊疗过程将会联合多个学科，使用多种技术方法辅助诊断，进而实现感染性疾病的精准诊治。
参考文献：
1. 佚名. 宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识[J]. 中华急诊医学杂志, 2019.
本文首发：医学界呼吸频道
本文讲者：南京大学附属金陵医院 施毅教授
本文作者：医学界CTS报道组-11
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