mRNA疫苗的纳米材料递送系统

COVID-19大流行将mRNA疫苗推向了生物技术和制药工业的中心阶段。疫苗开发的速度也超出了预期，在SARS-CoV-2序列公开10个月后就有疫苗面世。这一成功不仅证明了生物技术和制药工业有能力应对紧迫和未得到满足的全球需求，而且也证明了mRNA作为一种药物形式的固有能力，与常规疫苗相比，mRNA疫苗具有成本低、生产效率高、安全性高的优势，且拥有合成任何一种蛋白的潜能，因此，对于传统疫苗无力应对的新型传染性病毒有巨大应用潜力。然而，由于mRNA分子的不稳定性、先天免疫原性高及体内递送效率低等原因，mRNA疫苗的应用一直受到限制。要实现mRNA疫苗的广泛应用，需重点解决递送技术。mRNA 疫苗需要有合适的递送载体将其递送至体内，才能有更好的免疫效果，开发高效无毒的递送系统是 mRNA 疫苗成功的关键。美国乔治梅森大学生物工程系主任Michael D. Buschmann教授在综述中阐述了mRNA传递系统的发展，总结SARS-CoV-2 mRNA疫苗的临床前和临床研究结果，重点介绍了目前SARS-CoV-2疫苗临床试验中使用的脂质纳米粒，并且对脂质纳米粒在mRNA疫苗中的作用进行了分析。

在COVID-19之前，mRNA疫苗已用于临床前和临床研究，包括流感，寨卡病毒，艾滋病毒，埃博拉病毒，狂犬病，疟疾，生殖器疱疹，弓形虫病等。在目前针对新型冠状病毒COVID19疫苗竞赛中，基于mRNA疫苗已初见成效，目前正在进行的mRNA疫苗人体试验共有八个，分别是由BioNTech/Pfizer、Moderna、CureVac、Sanofi/TranslateBio、Arcturus/Duke NUS新加坡医学院、伦敦帝国理工学院、泰国Chula-longkorn大学和Providence Therapeutics领导。值得注意的是，其中两项试验公布了中期第3阶段试验结果，报告了两次30µg或100µg剂量后编码棘突蛋白免疫原的mRNA序列（以脂质纳米颗粒形式递送）以及SARS-CoV-2感染率降低94%以上的疗效。

mRNA疫苗的早期递送系统

递送技术平台是 mRNA 疫苗的关键之一，已经有大量的mRNA制剂系统见诸报道，其中的很多已经进入临床试验阶段。这些制剂技术都是通过形成特殊的mRNA载体，来实现mRNA疫苗的递送，这些载体技术包括：鱼精蛋白载体技术、纳米颗粒脂质体载体技术、多聚体载体技术。

鱼精蛋白载体技术：鱼精蛋白是一种天然的阳离子蛋白，可以把带负电的mRNA分子络合成纳米级别的核酸颗粒，从而保护mRNA不被血清中的RNA酶降解；但是由于鱼精蛋白和mRNA的结合太紧密，因此采用这种制剂的mRNA疫苗的蛋白表达效率会受限，另外抗原的表达很大程度上也受到鱼精蛋白和mRNA比例的影响。近年来，鱼精蛋白mRNA递送系统已广泛用于临床并获得了很好的临床治疗效果，例如CureVac采用了这种方法来生产狂犬病疫苗候选药物，CV7201，一种冻干的，温度稳定的未修饰的mRNA由编码狂犬病病毒糖蛋白的游离和鱼精蛋白复合mRNA组成。

用于mRNA传递的聚合物

几十年来，阳离子聚合物已广泛用于核酸递送，例如poly(L-lysine), PEI, DEAE-dextran, PBAE和壳聚糖。在最简单的形式中，阳离子聚合物与核酸过量混合形成静电结合的阳离子聚合物。尽管已经开发出许多聚合物，但是它们在核酸递送方面还不如脂质纳米粒那么先进，并且将它们成功地应用于疫苗的动物研究数量有限。

用于当前SARS-CoV-2临床试验的脂质纳米颗粒的开发

最早使用的脂质体递送材料是阳离子脂质体。带正电荷的阳离子脂质体与带负电荷的 mRNA 通过经静电作用聚集形成多层囊状复合物，称为脂质体复合物 (lipoplex，LP)，复合物中包封的 mRNA 不易被 RNase 降解，能被成功递送至细胞翻译成功能性蛋白。2 - 二油酰基羟丙基 - 3-N，N，N - 三甲铵氯(DOTAP) 和二油酰磷脂酰乙醇胺 (DOPE) 是已被证实有效的递送载体。阳离子聚合物具有浓缩 mRNA 的作用，mRNA 与聚合物浓缩后被阳离子脂质体包裹在囊状空腔中则形成脂质体聚合物(lipopolyplex，LPR)。LPR 最早用于 DNA 转染，后来也用于 siRNA 和 mRNA 转染。

脂质体纳米粒 LNP 一般由被脂质双层壳包围的水性核心组成，脂质双层壳由不同的脂质组成，每种脂质都发挥着不同的功能。LNP 是目前主流的递送载体之一。 由于其比较容易被抗原呈递细胞吸收，因此最常被用于疫苗，目前三大mRNA疫苗巨头企业，Moderna、CureVac和BioNTech均采用了LNP递送技术。

LNP通常由四种成分组成：可电离阳离子脂质、聚乙二醇、胆固醇和磷脂。目前，拥有LNP自主知识产权的公司主要包括ModeRNA、Arcturus、Acuitas、Arbutus、Genevant、艾博生物、深信生物等。而在传染性疾病领域的应用，进入临床试验阶段的仅ModeRNA、Arcturus、Acuitas和艾博生物。

mRNA脂质纳米颗粒的鼻内递送

对于mRNA疫苗，绝大多数研究和所有当前的临床试验都使用肌肉注射，而对皮内注射也进行了研究，通常与肌内途径平行。尽管到目前为止还没有高度发展，但是鼻内注射疫苗具有诸如激活等优点，可减少依赖于针为基础的免疫

疫苗mRNA递送系统性能的决定因素

mRNA传递系统性能的决定因素是多因素和相互作用的，包括：（1）它们传递到适当细胞并有效地将mRNA释放到细胞质翻译机制的效力或能力；（2）它们的佐剂性，可以增强免疫应答；（3）使任何贡献最小化可能由注射部位过度炎症或全身分布和靶向表达引起的不良事件或毒性。

脂质纳米粒在当前SARS-CoV-2临床试验中的应用

1.BioNTech /辉瑞

Acuitas ALC-0315（表2）与DSPC、胆固醇和聚乙二醇-脂质结合是BioNTech的SARS-COV-2试验中的输送系统。CureVac和伦敦帝国学院也可使用ALC-0315，或可能使用A9（表2）。BioNTech开始开发其SARS-CoV-2疫苗，其中4个mRNA编码免疫原，其中两个是核苷修饰的，一个未修饰，一个是自扩增的。报告可用于两种核苷修饰的mRNAs：BNT162b1是一个短~1kb的序列，编码spike蛋白的受体结合域，经foldon三聚化域修饰以通过多价展示增加免疫原性。较长的4.3kb BNT162b2编码一种二丙氨酸稳定的全长膜结合蛋白。BNT162b2最近获得了欧盟和美国的紧急批准。

2.Moderna

Moderna公司的mRNA-1273是一款基于mRNA，编码全长新冠病毒刺突蛋白的疫苗。它设计用来诱导中和抗体，中和抗体指向冠状病毒SARS-ConV-2“刺突”蛋白的一部分，该病毒利用刺突蛋白结合并进入人体细胞。在Moderna的研究中，核苷修饰的mRNA编码的免疫原是一种跨膜锚定的二丙氨酸稳定的融合前峰，具有天然的furin裂解位点，并在LNP中传递，该LNP遵循原型MC3 LNP，但用脂质H（SM-102）代替MC3。

3.CureVac

CureVac的mRNA疫苗CVnCoV是由脂质纳米粒子（LNP）封装的、序列优化的基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗，它编码全长的、预融合稳定的S蛋白。与其他基于mRNA的方法不同，CVnCoV完全由非化学修饰的核苷酸组成，可以在相对较低的剂量下应用。

4.Translate Bio

Translate Bio使用未修饰的mRNA编码双突变形式的双脯氨酸稳定的刺突蛋白以LNP的形式传递可离子化脂质C12-200，但可能是来自ICE或基于半胱氨酸的可电离脂质家族。该疫苗在非人类灵长类动物身上进行了研究，大多数灵长类动物在一剂疫苗后产生了中和抗体，所有生物的抗体效价在第二剂疫苗后都达到了明显高于人类康复血清中的水平。

5.Arcturus

Arcturus Therapeutics公司的LUNAR-COV19是一种极低剂量，潜在的单次（im）单次自我复制mRNA疫苗，不含任何病毒物质或辅助佐剂。临床前体外数据显示，施用LUNAR-COV19可以有效表达COVID-19病毒刺突蛋白，即形成保护性抗体的抗原Arcturus已完成1期临床试验，剂量为1-10µg，并选择了7.5µg进行3期试验。

6.伦敦帝国理工学院

伦敦帝国理工学院研发的Acuitas LNP中递送的自我扩增型RNA疫苗能有效地向人体肌肉中注射新的遗传密码，引导肌肉产生一种出现在新型冠状病毒表面的蛋白质，从而让其产生保护性的免疫反应。该疫苗的1期临床试验即将开始

7.宾夕法尼亚大学、朱拉隆功大学

朱拉隆功大学与宾夕法尼亚大学合作，使用Genevant开发天然的穗状免疫原核苷修饰的mRNA LNP，可能是CL1脂质。他们的目标是在2021年第一季度开始第一阶段的临床试验，在2021年第4季度开始向泰国及附近的7个低收入国家分发疫苗。

8.Providence Therapeutics

Providence therapeutics获得了加拿大卫生部的授权，可以进行PTX-COVID-19B mRNA LNP疫苗的人体临床试验。第一阶段临床试验计划于2021年第一季度开始，疫苗的生产和销售将在同一年获得监管部门的批准。

9.储存与分配

实验室制造的大多数RNA LNP在4℃下稳定数天，但随后表现出尺寸增大和生物活性逐渐丧失，如荧光素酶表达。为了稳定mRNA-LNP疫苗的储存和分发，需要一种冷冻形式。Moderna COVID-19疫苗需要在25℃到15℃之间储存，但也可以在2℃到8℃之间稳定30天，在8℃到25℃之间稳定12小时。Pfizer/BioNTech COVID-19疫苗需要在80℃至60℃的温度下储存，然后解冻并在2℃至8℃的温度下储存最多5天，然后在注射前用生理盐水稀释。在分发和储存期间，辉瑞公司疫苗所需的干冰温度比Moderna疫苗所需的常规冷冻室温度更难达到。这些温差背后的原因并不明显，因为两种疫苗都含有类似的高浓度蔗糖作为冷冻保护剂。Moderna mRNA LNP在两种缓冲液中冷冻，即Tris和醋酸盐，而辉瑞/生物泰克疫苗仅使用磷酸盐缓冲液。众所周知，磷酸盐缓冲液不适合冷冻，因为它们易于沉淀，并在冰结晶开始时导致pH值突然变化。冷冻干燥对mRNA LNPs一直是一个挑战。然而，Arcturus已经声明他们的COVID-19 mRNA疫苗在冻干形式下是稳定的，这可能会大大简化分布，尽管这种冻干制剂的温度稳定性尚未披露。

总结

在过去的二十年中，mRNA治疗学的进展是非同寻常的，首先是通过修饰核苷和序列工程来确定控制mRNA固有免疫原性的方法，以及mRNA在疫苗和其他治疗适应症中的应用。脂质纳米粒原型机的采用使得脂质纳米粒的递送效率比以前的系统提高了一个数量级，并且正在不断提高，这主要是由于新型可电离脂质的设计。mRNA-LNP的结构、功能、效价、靶向性和生物学特性，如佐剂性等许多方面仍有待于探索，以充分发挥这种强大的和具有变革性的治疗方式的潜力。

为了推动全球新冠疫苗的研发进度，促进各国研发机构间的交流合作和信息共享，解决临床研究中存在的问题和可能面临的风险挑战，由四叶草会展、生物制品圈等单位主办的2021全球新冠疫苗研发峰会将于5月16-17日在中国上海举行。本届峰会以“全球合力、加速研发”为主题，组委会将邀请国际国内主要新冠疫苗研发机构代表围绕研发进展情况、工艺和质量控制、临床研究进展、注册和申报等内容进行深入研讨。

会议内容

时间：2021年5月16-17日

地点：上海（具体地点报名后通知）

规模：500-600人

主办单位：四叶草会展、生物制品圈

协办单位：Cytiva中国

支持单位：南京诺唯赞生物

会议费用：为疫苗技术研发人员提供参会福利，4月8日之前报名FREE!（仅收取100元定金，仅含茶歇、会议资料，定金缴纳后概不退还），先到先得，报完即止，4月8日以后报名将收取会议费！