采用孕妇血浆中胎儿来源游离DNA（cell free fetal DNA，cfDNA）进行二代测序，通过生物信息学分析，用于产前胎儿非整倍体风险评估，称作无创产前检查（noninvasive prenatal testing，NIPT），对于提高产前筛查效率具有巨大潜力。自2011年NIPT开始临床应用以来，短短几年间，这一技术迅速得到推广，积累了大量经验，同时引发了一系列从基础理念到实际应用的相关研究和争论。国际上，各大学术组织也积极响应，对规范指南进行相应修正，在循证医学基础上，对某些关键问题给予解读和建议。例如，NIPT适用范围能否扩大到'非整倍体低风险人群'及其相应利弊，检查范围能否进一步扩展到其他染色体非整倍体甚至微缺失/微重复等。本文就国际上极具影响力的两大学术组织–国际产前诊断学会（International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）和美国妇产科医师学会（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）2015年最新的NIPT相关指南进行解读。
2015年4月ISPD通过了'染色体异常筛查委员会'立场声明，其中用了一半篇幅，针对cfDNA胎儿非整倍体筛查的临床应用给出建议[1]。同年9月，ACOG联合美国母胎医学学会（Society of Maternal-Fetal Medicine）发表第640号母胎医学遗传学会委员会意见，专门给出cfDNA用于胎儿非整倍体的筛查指南[2]。国际组织和美国两项指南均充分考虑到现有研究成果，在具有一定共识的同时，也包括一些侧重点的不同，甚至存在一些差异。
两指南充分肯定，现有对于21和18号染色体三体筛查的敏感性和特异性很高，而13号和性染色体非整倍体敏感性相对降低，平均为80%~90%，但特异性超过99%。见表1，表2。
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表1 应用胎儿来源游离DNA筛查胎儿21-、18-和13-三体和X单体的检出率和假阳性率（%）[1] |
应用胎儿来源游离DNA筛查胎儿21-、18-和13-三体和X单体的检出率和假阳性率（%）[1]
| 研究 | 21-三体 | 18-三体 | 13-三体 | X单体 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 检出率 | 假阳性率 | 检出率 | 假阳性率 | 检出率 | 假阳性率 | 检出率 | 假阳性率 | ||
| 鸟枪法大规模平行测序 | 99.2（653/658） | 0.2（16/10 061） | 96.3（156/162） | 0.1（10/9 937） | 83.9（47/56） | 0.2（20/10 006） | 87.3（48/55） | 0.2（14/6 268） | |
| Chiu等 | 100.0（86/86） | 2.1（3/146） | － | － | － | － | － | － | |
| Ehrich等 | 100.0（39/39） | 0.2（1/410） | － | － | － | － | － | － | |
| Palomaki等 | 98.6（209/212） | 0.2（3/1 471） | 100.0（59/59） | 0.3（5/1 688） | 11/12b | 0.9（16/1 688） | － | － | |
| Bianchi等a | 98.9（89/90） | 0.0（0/410） | 92.1（35/38） | 0.0（0/463） | 11/16b | 0.0（0/485） | 75.0（15/20） | 0.2（1/462） | |
| Liang等 | 100.0（40/40） | 0.0（0/372） | 14/14b | 0.0（0/398） | 4/4b | 0.2（1/408） | 5/5b | 0.2（1/407） | |
| Song等 | 8/8b | 0.0（0/1 733） | 2/2b | 0.1（1/1 739） | 1/1b | 0.0（0/1 740） | 2/3b | 0.0（0/1 737） | |
| Mazloom等 | － | － | － | － | － | － | 17/18b | 2.8（11/393） | |
| Stumm等 | 97.6（40/41） | 0.0（0/430） | 8/8b | 0.2（1/463） | 5/5b | 0.0（0/466） | － | － | |
| Porreco等 | 100.0（137/137） | 0.1（3/3 185） | 92.3（36/39） | 0.0（0/3 283） | 14/16b | 0.0（0/3 306） | 9/9b | 0.3（11/3 269） | |
| Bianchi等 | 5/5b | 0.3（6/1 904） | 2/2b | 0.2（3/1 903） | 1/1b | 0.2（3/1 913） | － | － | |
| 靶向大规模平行测序 | 99.5（194/195） | 0.0（10/21 415） | 97.0（97/100） | 0.0（5/20 963） | 10/12b | 0.0（3/13 122） | 91.5（43/47） | 0.0（0/125） | |
| Ashoor等 | 100.0（50/50） | 0.0（0/297） | 98.0（49/50） | 0.0（0/297） | 8/10b | 0.1（1/1 939） | － | － | |
| Norton等 | 100.0（81/81） | 0.1（1/2 887） | 97.4（37/38） | 0.1（2/2 888） | － | － | － | － | |
| Nicolaides等 | 8/8b | 0.0（0/1 941） | 2/2b | 0.1（2/1 947） | － | － | 91.5（43/47） | 0.0（0/125） | |
| Verweij等 | 7/18b | 0.0（0/486） | － | － | － | － | － | － | |
| Norton等 | 100.0（38/38） | 0.1（9/15 803） | 9/10b | 0.0（1/15 831） | 2/2b | 0.0（2/11 183） | － | － | |
| 基于单核苷酸多态性测序 | 100.0（83/83） | 0.0（0/1 109） | 96.4（27/28） | 0.1（1/1 165） | 13/13b | 0.0（0/1 181） | 11/12b | 0.1（1/1 182） | |
| Nicolaides等 | 100.0（25/25） | 0.0（0/204） | 3/3b | 0.0（0/226） | 1/1b | 0.0（0/228） | 2/2b | 0.0（0/227） | |
| Pergament等 | 100.0（58/58） | 0.0（0/905） | 96.0（24/25） | 0.1（1/939） | 12/12b | 0.0（0/953） | 9/10b | 0.1（1/955） | |
| 合计 | 99.4（930/936） | 0.16（26/32 585） | 96.6（280/290） | 0.05（16/32 065） | 86.4（70/81） | 0.09（23/24 309） | 89.5（102/114） | 0.2（15/7 575） | |
注：仅限回顾性研究，对于前瞻性研究结果考虑到不确定性以及生存偏倚予以剔除；a结果未能分类定为阴性结果；b分母小于20不计算百分率；'－'表示无数据
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表2 检测结果明确的胎儿来源游离DNA检测评价指标（%）[2] |
检测结果明确的胎儿来源游离DNA检测评价指标（%）[2]
| 项目 | 敏感性 | 特异性 | 阳性预测值 | |
|---|---|---|---|---|
| 25岁 | 40岁 | |||
| 21-三体 | 99.3 | 99.8 | 33 | 87 |
| 18-三体 | 97.4 | 99.8 | 13 | 68 |
| 13-三体 | 91.6 | 99.9 | 9 | 57 |
| 性染色体非整倍体 | 91.0 | 99.6 | －a | －a |
注：分别选取25岁和40岁孕妇妊娠16周时非整倍体发病率为模型，阴性预测值并未列于表中，但在所有人群中均高于99%，如果检测失败，阴性预测值将会降低；a性染色体非整倍体的阳性和阴性预测值结果因类型各异，但阳性预测值为20%～40%。根据检查手段的敏感性和特异性，当筛查人群21-三体总体发病率为1/1 000时，异常结果的阳性预测值为33%，即每3例异常结果的仅有1例胎儿真实患病。如果发病率为1/75，则阳性预测值为87%；'－'表示无数据
随着NIPT检测验证性研究从高危人群到中、低风险人群的拓展，无论风险如何，NIPT均可以应用于常见非整倍体的产前筛查。
考虑到存在NIPT结果不准确的可能性，同时常见的非整倍体类型与再发风险相关，NIPT阳性结果后续只能通过产前诊断获得胎儿细胞确诊。包括终止妊娠在内的任何临床决策不得仅依据单一NIPT的结果。
NIPT检测的风险和获益均应在检测前明确告知孕妇。对于获益，应客观描述NIPT针对不同非整倍体的检出率、假阳性率和检测失败的可能性。风险方面，应交代假阳性可能（胎盘嵌合、双胎之一消失和母体肿瘤）；对于NIPT高危结果，采用其他检查加以确认的必要性；鉴于NIPT检测原理，可能发现母、胎甚至获得性（如某些肿瘤）染色体异常、临床意义不清的拷贝数变异等可能；其他传统产前筛查、诊断方法的选择也应提供给孕妇。
不同NIPT实验室存在这类病例的报告，其原因可能与孕妇体重（肥胖）、孕周乃至实验室操作常规有关。但需要强调的是，重复取样后，仍有检测失败的可能。此外，近期研究结果提示，检测失败与胎儿部分非整倍体类型、三倍体可能相关，有必要进一步遗传咨询、密切监测超声，综合评判，决定进一步后续检查。
目前不同实验室开始将NIPT拓展到21、18或13号染色体三体以外的异常筛查。但目前研究有限，很多微缺失/微重复存在拷贝数变异以外的其他致病机制，并不能检出。
目前NIPT开始拓展到双胎，初步研究提示双胎妊娠NIPT筛查效率类似于单胎妊娠。
最早自妊娠9周开始。
除上述热点问题的解读外，ACOG指南还特别强调下列内容。
尽管不同实验室出具报告的模式不同，但对于孕妇，明确而便于理解的信息，包括每种非整倍体的阳性预测值以及残余风险（阴性结果假阴性可能）非常重要。如表2，特别给出了不同年龄人群中阳性预测值的差异。
研究表明，低风险人群可选择NIPT检测，敏感性和特异性与高危人群类似，但阳性预测值低于高危人群，即NIPT高危但胎儿真正受累比例降低（图1）。此外，NIPT用于低风险人群的另一局限还在于，低风险人群中染色体异常中NIPT所涵盖的检测范围仅占一小部分，而传统的血清学筛查同时能筛查其他染色体异常（如13、18、21号染色体以外的其他染色体不平衡性重排）和不良妊娠结局，同样地，对于高风险人群的诊断性检查能够发现17%存在NIPT检查范围外、而临床意义明确的染色体异常。考虑到NIPT与传统筛查各自的利弊，传统筛查仍应作为大部分孕妇的一线筛查方法。
强调不适用NIPT检测的人群，即超声发现胎儿结构异常，应建议诊断性而非筛查性检查；家族史明确是否需要其他筛查或诊断检测；NIPT不能评估胎儿神经管畸形和腹壁缺损风险。ACOG指南还强调了NIPT同时检测甲胎蛋白和进行超声评估的必要性。尽管NIPT作为传统筛查方法高风险而拒绝介入性产前诊断的后续筛查方案是合理的，但应强调，这种情况下NIPT低风险时，残余风险为2%；孕妇在明确各种筛查诊断的利弊后，可以选择甚至拒绝任何筛查诊断方法。
尽管如表1所述，NIPT能够评价胎儿部分性染色体异常，及X单体，但对于47,XXX/XXY/XYY，或性染色体嵌合或不同类型的Turner综合征等类型，NIPT的假阳性率尚存在争议。如果NIPT常规包含性染色体异常，在检测前还应告知同时发现'母、胎两方'性染色体异常的可能；某些性染色体异常表现轻微，甚至没有临床意义。从而做出检测前的知情选择。
cfDNA主要来源于滋养层细胞，其染色体核型可能与胎儿不完全一致。又称'限于胎盘的嵌合'。胎儿/胎盘的不一致造成NIPT假阳性或假阴性，而真实存在胎儿嵌合也是可能的原因之一。所有检查cfDNA的方法都需要母体血浆中含有足够多的胎儿/胎盘cfDNA，很多实验室都有出具检测报告所必需的最低标准。此外，胎儿组分低的现象似乎与18、13号染色体三体和X单体、三倍体相关。但还没有足够证据证实极低胎儿组分病例中染色体异常的发生率。如果实验室不能检测胎儿组分，当样本胎儿组分极低造成试验失败时，可能会误导筛查结果，在总体分析时高估NIPT敏感性。但尚不确定胎儿组分究竟低到何种程度会造成假阳性和假阴性。
对于母体或胎儿来源的染色体不平衡，鸟枪法大规模平行测序和靶向大规模平行测序并不能加以区分，因此出现母体染色体异常（全身性或体细胞获得性），甚至小的拷贝数变异都可能造成假阳性率。此外还易于发生'未检出的消失双胎'造成的假阳性或性别错误。
由于cfDNA和绒毛活检都来自于胎盘细胞，因此绒毛活检用于后续诊断时应充分考虑'限于胎盘的嵌合'的可能。对于胎儿的真实核型，羊水细胞的取材分析更为适宜可靠。妊娠早期的cfDNA筛查确实能够尽早识别乃至尽早干预高危者，但需要权衡能否在妊娠早期完成确证诊断。
在临床选择异常种类时，应限于临床意义明确的严重表型类别。现有微缺失综合征检测包检查范围内的疾病，其产前发生率尚未明确。微缺失微重复综合征检查会出现假阳性，但该检测项目中所有疾病的'累积假阳性'需要足够低。且每种疾病阳性预测值应相互类似。所有检测范围内的疾病，对于医患双方可能都并不熟悉，因此需要提供相应信息材料和专业咨询。
同时，由于并不存在可供比较的筛查方法，也不易获取到受累妊娠的检测样本从而用于比较，因此证实检出率和假阳性率还存在争议。当筛查效率仅基于有限样本、实验数据、甚至推测时，相关的解释信息和实际数据应提供给临床专业人员和准备选择筛查项目的患者。
提供NIPT检测实验室应遵从特定准入标准，包括流程、报告、样本及数据存储、病例信息保密，都应详细规定。备查流行病学信息、失败率、报告周期等细节。人员还应定期接受熟练度测试。
针对现有问题，ISPD指南还特别呼吁，随着筛查涉及范围不断增大，如何清晰解释不同检查策略带来的挑战，需要支持从事产前诊断的产科医师和其他涉及筛查工作的人员继续教育、开发患者教育手册、扩大遗传咨询覆盖范围；支持能够针对具重要临床意义的染色体异常，采用覆盖广泛、价格适中、质量保证的产前筛查模式，同时辅以遗传咨询和后续诊断支持。目前尚缺乏cfDNA筛查相关的质量控制和保障指南，强烈建议提供相关服务的实验室应遵守其他分子检测国家级实验室质量控制和熟练度测评指南。建议尽快推出针对cfDNA筛查的特定相关文件。
尽管两项指南前后相距半年左右时间，但对某些关键问题，两者仍然存在某些差异。例如，ACOG建议，在正常妊娠时，低风险人群最适宜的一线筛查仍应选择'传统筛查方法'。ISPD提出3种NIPT应用模式，一是用于所有孕妇的一线筛查方法；二是在其他筛查结果为高危时进一步评价风险；三是其他筛查高危则直接建议行介入性产前诊断，而临界风险则建议行NIPT再评价。此外，对于双胎妊娠，尽管ACOG充分肯定现有证据，但不建议用于包括双胎妊娠在内的多胎妊娠，而ISPD仅在三胎或以上的多胎妊娠时才不建议应用NIPT。类似地，对于NIPT应用范围的拓展，ACOG不建议常规筛查微缺失综合征，而ISPD建议，当cfDNA筛查扩展用于微缺失和微重复综合征或其他罕见三体时，检查范围应仅限于具有明确临床意义、严重的疾病类型。所筛查的每种疾病应明确检出率、假阳性率和疾病相关信息。
我国自2011年开始商业应用NIPT技术以来，经历了2014年全面叫停，2015年初在全国试点开展至今，同样累计了大量的经验和数据，并出台了我国高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范。相信随着进一步的基础应用研究、评估和讨论，这项技术的临床应用必将不断得到完善和规范。
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