科研 | Environmental Pollution：砷对许氏平鲉幼鱼毒理学效应的代谢组学和蛋白...
砷作为海洋环境中普遍存在的一种非金属元素，因其潜在的毒性，环境中的砷污染已经引起了世界范围的广泛关注。砷暴露能够诱使动物产生多种不良反应，例如脂质代谢紊乱，免疫系统异常，氧化应激和致癌作用等。在自然环境中，无机砷以两种化学形态存在：亚砷酸盐(As (III))和砷酸盐(As (V))。在环境水中，砷主要以砷酸盐(As (V))的形式存在。本研究以许氏平鲉幼鱼为研究对象，借助于代谢组学和蛋白质组学技术，探究了14 天的环境相关浓度砷(V)暴露对许氏平鲉幼鱼的毒性效应机制。基于iTRAQ定量蛋白质组学和基于核磁共振的非靶向代谢组学的分析结果显示，砷(V)对许氏平鲉幼鱼具有明显的毒性作用。具体表现为，砷(V)暴露组中的许氏平鲉幼鱼体内包括乳酸、丙氨酸、三磷酸腺苷、肌苷和磷酸胆碱在内的代谢物发生显著改变。蛋白组学分析结果显示，砷暴露(V)不仅影响能量和基础代谢以及信号传导，还引起了许氏平鲉幼鱼体内细胞骨架构架发生变化。整个研究结果表明，采用蛋白质组学和代谢组学相结合的研究方法有助于探明污染物对许氏平鲉的毒理学效应。
原名：Toxicological effects of As (V) in juvenile rockfish Sebastes schlegelii by a combined metabolomic and proteomic approach译名：砷对许氏平鲉幼鱼毒理学效应的代谢组学和蛋白质组学研究期刊：Environmental Pollution本研究以许氏平鲉幼鱼为研究对象，开展砷暴露实验。实验用72尾许氏平鲉幼鱼（体长6.5-7.0 cm）均购于中国烟台当地一家养殖场，在实验室条件下驯养一周。将许氏平鲉幼鱼随机分成3组（对照组、5 μg/L砷(V)暴露组和50 μg/L砷(V)暴露组），每组设置两个水箱，每个水箱饲养12尾鱼。已有报道，渤海湾某些地区的砷浓度可达12.4 μg/L，故本研究中设置的砷暴露浓度为环境相关浓度的相同数量级水平。在许氏平鲉幼鱼驯养和暴露实验期间，光照时间为12小时/天，并每天定时投喂饵料。暴露周期为14天，暴露结束后采集所有许氏平鲉幼鱼个体，将整尾鱼放入液氮中速冻并研磨成均匀粉末，然后将样品粉末分装于三支管冻存管中，保存于-80℃超低温冰箱中备用。准确称取约 100 mg许氏平鲉幼鱼组织样本，加入 4 mL/g的甲醇溶剂后匀浆，先后加入5.25 mL/g的水和2 mL/g的氯仿进行提取，静置后取甲醇水层进行核磁共振分析。利用基于 MATLAB 平台的 ProMetlab软件（V7.0，MathWorks, USA），将0.2-10 ppm 内的谱图以 0.005 谱宽进行分段积分。先将所有归一化的核磁数据进行对数转化处理（常变量转换因子，λ=2×10-9），然后将预处理后的数据进行多元统计分析。准确称取约 0.1 g许氏平鲉幼鱼样本，加入预冷的苯酚提取液提取蛋白，采用BCA法确定蛋白提取液浓度，利用iTRAQ技术进行定量蛋白组学分析。使用 iTRAQ 8-plex 试剂盒对8 个鱼样品（对照组 2 个，5 μg/L砷暴露组和50 μg/L砷暴露组各2 个）中的肽进行标记，将测得的数据导入Protein Pilot (V5.0, AB SCIEX, USA)软件进行分析处理。将质谱采集的数据与质谱库中的数据进行匹配以鉴定蛋白。当p<0.05 且平均iTRAQ 比率≥ 1.3或≤ 0.77时视为存在显著性差异。每组取 9 个许氏平鲉幼鱼粉末样本，在80℃条件下烘干至恒重，加入 70%的浓 HNO3后进行微波消解，200℃保持 15 分钟，待消化液消解完全，冷却至室温，用超纯水定容至 10 mL，采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）(安捷伦7500i, 安捷伦科技, USA)进行砷含量测定。运用 SPSS 软件进行数据分析，p<0.05视为存在显著性差异。水体中的金属污染物在鱼体内具有明显的生物富集效应。本研究采用ICP-MS 测定了对照组及环境相关浓度砷(V)暴露组中许氏平鲉幼鱼体内总砷含量。如图1 所示，低浓度砷暴露组（5 μg/L）和高浓度砷暴露组（50 μg/L）中许氏平鲉幼鱼体内砷含量与对照组相比均存在显著差异。数据显示，砷暴露14 天后，低浓度砷暴露组（5 μg/L）和高浓度砷暴露组（50 μg/L）中许氏平鲉幼鱼体内总砷含量分别为1.37 ± 0.17 和 1.41 ± 0.07 μg/g。然而，低剂量砷暴露组（5 μg/L）和高剂量暴露组（50 μg/L）中许氏平鲉幼鱼体内砷含量仅高出对照组17.1% 和20.5%。此外，两个不同浓度砷暴露组之间不存在显著差异。图1 经砷暴露（5 μg/L和50 μg/L）14 天后，许氏平鲉幼鱼体内平均砷含量。浓度表示为平均值±标准差。P<0.05 时，具有显著统计学意义。
经不同浓度砷暴露14 天后，在许氏平鲉幼鱼组织提取物中共鉴定出 34 种代谢物（图 2），主要包括氨基酸（支链氨基酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸，甘氨酸等）、有机酸（乳酸和乙酸）、能量代谢产物（磷酸胆碱、磷酸肌酸、葡萄糖和三磷酸腺苷（ATP））、三羧酸循环中间产物（延胡索酸和琥珀酸）及渗透调节物（牛磺酸、二甲胺与氮氧三甲胺）等。利用主成分分析法对对照组和砷暴露组中许氏平鲉幼鱼组织代谢物的核磁共振光谱数据进行分析，结果显示，对照组和不同浓度砷暴露组在主成分1轴和主成分2 轴上可分别实现显著区分（图 3）。此外，在 PC2 轴上，两个不同浓度砷暴露组可实现显著区分，这表明不同浓度砷暴露组存在显著代谢差异。然后，运用正交偏最小二乘判别分析法分析从对照组和砷暴露组的许氏平鲉幼鱼样本中采集的核磁共振光谱数据。如图 4A 和 4B 所示，该正交偏最小二乘模型稳健性和可靠性良好，Q 值分别为0.886 和0.651。从载荷图（图 4C）上可以观察到，低浓度砷暴露组(5 μg/L)中二甲胺、磷酸胆碱、葡萄糖和肌苷水平上升，而乳酸、丙氨酸、琥珀酸和ATP水平下降。与低浓度砷暴露组(5 μg/L)相比，在高浓度砷暴露组(50 μg/L)中（见图 4D）发现代谢物发生类似响应：磷酸胆碱和肌苷水平上升，而乳酸、丙氨酸、琥珀酸和三磷酸腺苷水平下降。但仅在高浓度砷暴露组(50 μg/L)中发现甘氨酸和组氨酸水平下降，亮氨酸和精氨酸水平上升。图2 许氏平鲉幼鱼组织提取物的典型核磁共振谱图。（A）对照组（B）5 μg/L砷暴露组（C）50 μg/L砷暴露组。重要代谢物：（1）胆酸，（2）异亮氨酸，（3）亮氨酸，（4）缬氨酸，（5）乙醇，（6）3-氨基异丁酸，（7）乳酸，（8）苏氨酸，（9）丙氨酸，（10）精氨酸，（11）乙酸，（12）谷氨酸，（13）谷氨酰胺，（14）琥珀酸，（15）未知物 1（2.56 ppm），（16）天冬氨酸，（17）二甲胺，（18）天冬酰胺，（19）二甲基甘氨酸，（20）磷酸肌酸，（21）胆碱，（22）磷酸胆碱，（23）氧化三甲胺，（24）牛磺酸，（25）甘氨酸，（26）肌苷酸，（27）β-葡萄糖，（28）α-葡萄糖，（29）肌苷，（30）三磷酸腺苷，（31）延胡索酸，（32）酪氨酸，（33）组氨酸，（34）苯丙氨酸。
图3 许氏平鲉幼鱼组织提取物核磁共振光谱数据的PC1和PC2平均主成分分析（PCA）得分图。(♦)对照组；(■) 5 μg/L砷暴露组；(▲) 50 μg/L砷暴露组。
图4 许氏平鲉幼鱼组织提取物核磁共振光谱数据的正交偏最小二乘回归分析（O-PLS-DA）得分图。(♦)对照组；(■)砷暴露组；（A）对照组 Vs. 5 μg/L砷(V)暴露组; （B）对照组 Vs. 50 μg/L砷暴露组；（C）和 （D）为相应的系数图。彩图展示了对照组与砷暴露组之间代谢物变化的贡献程度。正方向的峰表示该代谢物在砷暴露组中丰度更高，相应的，在负方向的峰表示该代谢物在对照组中丰度更高。重要代谢物：（1）乳酸，（2）丙氨酸，（3）琥珀酸，（4）二甲胺，（5）磷酸胆碱，（6）葡萄糖，（7）肌苷，（8）三磷酸腺苷，（9）亮氨酸，（10）精氨酸，（11）甘氨酸，（12）组氨酸
经砷暴露14天后，在高低不同砷浓度暴露组（5 μg/L和50 μg/L）的许氏平鲉幼鱼样本中共鉴定出2053个蛋白，其中163个蛋白发生显著变化。在低浓度砷暴露组（5 μg/L）中，137个蛋白发生变化，包括上调的87 个蛋白和下调的54个蛋白。而在高浓度砷暴露组（50 μg/L）中，仅发现39个蛋白发生变化，包括22 个上调的蛋白和17个下调的蛋白。这些蛋白的变化差异表明，许氏平鲉幼鱼采用不同的策略以适应不同浓度（5 μg/L和50 μg/L）的砷暴露环境。在这些差异表达蛋白中，共有13个蛋白在低浓度和高浓度砷暴露组的样本中均发生变化。对这些差异表达蛋白进行生物学功能分类，见图 5。在低浓度砷暴露组(5 μg/L)中鉴定出的差异表达蛋白涉及的主要功能有：代谢(46.97%)、信号传导(13.64%)和细胞骨架(12.12%) (图5A)。与此同时，在高浓度砷暴露组(50 μg/L)中发生变化的差异表达蛋白也主要涉及代谢及信号传导功能，占比分别为32.26% 和29.03% (图5B)。具体的差异表达蛋白信息见表1。后续的GO富集分析和KEGG通路分析均基于以上差异表达蛋白数据。分析结果表明，大部分差异表达蛋白与代谢相关。GO 富集分析结果显示，大多数差异表达蛋白位于细胞内(35%)和细胞器中(35%)。此外，鉴定出的绝大多数差异表达蛋白具有催化活性和结合活性(图6)。KEGG 通路分析结果显示，在低浓度和高浓度砷暴露组(5 μg/L和50 μg/L)中共匹配到11条通路，其中有4条KEGG通路在高低浓度砷暴露组(5 μg/L和50 μg/L)中均有涉及，包括糖酵解/糖异生、碳代谢、氨基酸合成和酮体降解通路。而丁酸甲酯代谢和支链氨基酸降解代谢通路仅在高浓度砷暴露组(50 μg/L)发现。图5 砷暴露组(A.5 μg/L和B.50 μg/L) 中许氏平鲉幼鱼体内差异表达蛋白种类。
图6 砷暴露组(5 μg/L和50 μg/L)中许氏平鲉幼鱼体内的基于基因本体的蛋白分类。棒状图中红色分别代表5 μg/L和50 μg/L砷暴露组。
经不同浓度砷暴露(5 μg/L和50 μg/L)后，许氏平鲉幼鱼组织中的砷含量出现轻微显著性上升 (p< 0.05)。已有报道证实，砷同样可在海洋鱼类花身鯻体内发生轻微蓄积。但由于砷的生物利用度较低，所以大部分海洋生物，如虾、贝类和鱼等，对海水中砷的蓄积能力有限。尽管在高浓度砷暴露组(50 μg/L)中检出的总砷含量高于低浓度砷暴露组(5 μg/L)，但两者之间的差异并不显著。前人研究发现，砷可在许氏平鲉幼鱼肝、肾、脾脏、性腺和肠等组织中发生明显蓄积，且具有剂量依赖性，而对于肌肉组织，砷的蓄积现象在暴露浓度区间 50-200μg/L内并不明显。这是由于砷主要转移到较为活跃的器官，如肝、肾、脾脏等，从而导致砷肌肉中蓄积不明显。本研究中是将包括肌肉组织在内的整条鱼作为样品进行处理，所以由于高低浓度砷暴露(5 μg/L和50 μg/L)环境下肌肉组织中的砷蓄积程度相似，从而降低了两个砷暴露组间的差异。由上可知，砷的大量蓄积会对许氏平鲉幼鱼产生毒理学效应。糖酵解过程可以将葡萄糖代谢为丙酮酸和乳酸，在葡萄糖代谢过程中起到重要作用。本研究结果显示，经砷暴露后，与糖酵解过程相关的 7 种蛋白质（3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖-6-磷酸异构酶、烯醇酶2、烯醇酶3 和L-乳酸脱氢酶 A）存在差异变化。在这 7 种蛋白中，只有3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸甘油酸变位酶在砷暴露组（5 μg/L和50 μg/L）出现下调（图 7），且在低浓度砷暴露组（5 μg/L）中下降趋势更加明显。3-磷酸甘油醛脱氢酶作为一种糖酵解蛋白，在还原反应、丙酮酸生成和能量代谢中具有关键作用。磷酸甘油酸变位酶是糖酵解过程中另外一种关键酶，能够催化 3-磷酸甘油酸和 2-磷酸甘油酸之间的相互转化。3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸甘油酸变位酶的变化表明，砷暴露会抑制糖酵解过程。此外，在低浓度砷暴露组（5 μg/L）中，烯醇 3、L-乳酸脱氢酶A、果糖二磷酸醛缩酶、果糖-6-磷酸异构酶和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶均出现下调，同样表明砷暴露会抑制糖酵解过程。有趣的是，代谢组学分析结果显示，乳酸（一种糖酵解过程的产物）在砷暴露组中下降较为显著，仅次于丙氨酸。（图 4C 和 4D）。氨基酸是肉食性鱼类的主要能量来源，因为它们的天然饮食中蛋白质含量高而碳水化合物含量低。尤其是丙氨酸，研究证实丙氨酸是红鲑鱼迁徙途中用于肝脏中葡萄糖从头合成的重要来源。因此，砷暴露导致的乳酸和丙氨酸水平降低表明，砷暴露期间糖酵解及葡萄糖储备维持过程受到了抑制。在低砷浓度暴露组（5 μg/L）中发现，葡萄糖水平出现上升，这一现象与上述蛋白组的响应相一致。有研究人员发现，经砷暴露的菲律宾蛤仔体内，葡萄糖水平也会上升。然而，在经砷暴露后的菲律宾蛤仔和许氏平鲉体内，并未发现相同的差异表达蛋白。有趣的是，与对照组相比，低浓度砷暴露组（5 μg/L）中的烯醇2和果糖-6-磷酸异构酶出现过表达。这可能是由于糖酵解过程被抑制而出现的补偿反应，以此降低砷暴露对许氏平鲉幼鱼造成的损伤。早期研究揭示，砷暴露会加深斑马鱼体内糖酵解和乳酸发酵过程，这有点类似于瓦博格效应。而本研究中的结果则恰恰相反，这可能是由于砷暴露浓度过低所致。先人研究证明，3-磷酸甘油醛脱氢酶可作为“核内修复者”或凋亡前分子的核内载体，在细胞凋亡和氧化应激过程中发挥作用。已有报道结果显示，砷暴露会引起肺细胞中3-磷酸甘油醛脱氢酶表达发生下调。因此，由3-磷酸甘油醛脱氢酶下调可知，砷暴露导致许氏平鲉幼鱼体内出现了细胞凋亡和氧化应激。
相比于碳水化合物，鱼类更倾向于选择脂质和脂肪酸作为能量来源。经砷暴露后，许氏平鲉幼鱼体内与脂质代谢相关的3个蛋白发生变化，分别是3-羟甲基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMCLL1）、17-β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)和脂肪酸结合蛋白11a (FABP11A)。3-羟甲基-3-甲基戊二酰辅酶 A在脂质合成过程中具有重要作用，经砷暴露后，其表达水平升高最为显著。胆汁酸是脂质消化和吸收过程的促进剂，而17-β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)则是胆汁酸的调节中过程中的关键酶。该蛋白仅在低浓度砷暴露组(5 μg/L)中出现上调。这些差异表达蛋白可以说明，砷暴露促进了许氏平鲉幼鱼体内的脂质调节过程，以满足自身能量供应。但奇怪的是，在低浓度砷暴露组(5 μg/L)中，脂肪酸结合蛋白11a（FABP11A）却出现0.76 倍的轻微下调。作为脂肪酸结合蛋白中的一员，脂肪酸结合蛋白 11a（FABP11A）的主要在调节脂肪酸摄入和胞内运输中发挥作用。早前研究发现，脂肪酸结合蛋白主要在调节细胞增长和增殖中起作用。因此，脂肪酸结合蛋白11a下调可以说明，砷暴露会干扰许氏平鲉幼鱼体内细胞增长和增殖过程。有报道称，砷暴露会导致氨基酸代谢紊乱。经砷暴露后，斑马鱼体内的一些与能量代谢相关的氨基酸，如苏氨酸、甘氨酸等水平均下降。然而，另有研究者发现，砷暴露可能使淡水鱼种南亚野鲮体内蛋白质合成受到抑制，从而导致氨基酸含量升高。在本研究中，经低浓度或高浓度砷暴露后，许氏平鲉幼鱼体内精氨酸和亮氨酸含量显著升高，而丙氨酸、甘氨酸和组氨酸含量均降低(图4C和4D)。这些氨基酸对于三羧酸循环过程中的产能至关重要。此外，能量代谢过程中涉及的琥珀酸和ATP也发生了变化，以上均可说明砷暴露会导致许氏平鲉幼鱼体内能量代谢紊乱。天冬酰胺合成酶(ASNS)可以通过以谷氨酰胺为氮源的ATP 依赖性反应催化天冬酰胺的生物合成过程。低浓度砷暴露组(5 μg/L)中的天冬酰胺合成酶水平出现下调。核糖体蛋白是蛋白质合成过程中重要的功能性蛋白。经砷暴露后，许氏平鲉幼鱼体内的核糖体蛋白(RPL24, RPL3 and RPL27)水平也发生变化。氨酰tRNA通过转运氨基酸在核糖体蛋白合成过程中起关键作用，本研究发现，缬氨酰tRNA合成酶(VARS) 发生下调，天冬酰胺合成酶(ASNS) 发生下调，且核糖体蛋白组成发生变化，这均表明砷暴露干扰了蛋白质合成和降解过程。线粒体是参与能量代谢的主要细胞器，线粒体呼吸链是氧化磷酸化和 ATP 合成的主要部位，而细胞生存所需95%的能量均由线粒体呼吸链提供。线粒体呼吸链或电子传输链（ETC）均位于线粒体内膜上，由NADH泛醌氧化还原酶（复合物 I）、琥珀酸泛醌氧化还原酶（SQR）（复合物II）、泛醌-细胞色素 c还原酶（QCR）（复合物III）、细胞色素氧化酶（COX）（复合物IV）和F1F0-ATP合成酶组成。在本研究中，砷暴露导致的最显著变化之一是与氧化磷酸化和 ATP 合成相关的蛋白出现了上调。在高低浓度砷暴露组（5 μg/L和50 μg/L））中，许氏平鲉幼鱼体内的细胞色素 c氧化酶4(COX4)出现上调。与对照组相比，砷暴露组中许氏平鲉幼鱼体内的NADH脱氢酶（泛醌）黄素蛋白2(NDUFV2)、细胞色素 c 氧化酶亚基VIc（COX6C）、细胞色素 b-c1复合体亚基 6(UQCRH)和ATP 合成酶 F0 复合体也出现上调。早期研究发现，慢性刺激（食物剥夺、隔离及闪光灯照射等）会导致大鼠模型中的线粒体呼吸链复合蛋白失调。这些上调的蛋白表明，许氏平鲉幼鱼体内线粒体呼吸链受到干扰。有研究人员称，氧化磷酸化增强可能是个体应对外界刺激的一种适应性和保护性机制。因此，许氏平鲉幼鱼体内线粒体呼吸链的紊乱现象揭示了其在抵抗砷胁迫的能量调节过程。在砷暴露组（5 μg/L 和50 μg/L）中均发现，腺嘌呤核糖基转移酶（APRT）都出现过表达。腺嘌呤核糖基转移酶（APRT）的主要功能是促进 ATP 的合成。此外，异柠檬酸脱氢酶在三羧酸循环中必不可少。低浓度砷暴露组（5 μg/L）中上调的异柠檬酸脱氢酶以及高低浓度砷暴露组（5 μg/L 和50 μg/L）中变化的腺嘌呤核糖基转移酶均表明，砷暴露导致许氏平鲉幼鱼体内能量代谢发生了紊乱。此外，ADP/ATP比值升高能够刺激异柠檬酸脱氢酶的活性。因此，异柠檬酸脱氢酶上调意味着 ATP 可能出现降低（图 4C 和 4D）。代谢组学和蛋白质组学生物标志物的一致性表明，蛋白质组学和代谢组学在毒理学生物标志物的研究中具有互补性。菲律宾蛤仔经砷暴露后，其体内琥珀酸水平降低而ATP 水平提高，这与许氏平鲉体内的代谢组学变化恰恰相反。这种差异揭示了不同物种在砷胁迫条件下会表现出不同的响应。此外，NADH脱氢酶（泛醌）黄素蛋白2(NDUFV2)是NADH脱氢酶家族中重要的亚酶，与线粒体中自由基的产生密切相关。NADH脱氢酶（泛醌）黄素蛋白2(NDUFV2)的高表达表明，在低浓度砷暴露组(5 μg/L)中的许氏平鲉幼鱼体内发生了明显的氧化应激反应。显然，柠檬酸脱氢酶可以通过产生 NADH来参与氧化还原反应。柠檬酸脱氢酶发生上调，且NADH脱氢酶（泛醌）黄素蛋白2(NDUFV2)出现过表达，两种物质相同的变化趋势足以说明低浓度砷暴露(5 μg/L)导致许氏平鲉幼鱼体内产生了氧化应激反应。统计学结果显示，经砷暴露的许氏平鲉幼鱼体内4种胶原蛋白发生极显著上调。胶原蛋白不仅赋予了多细胞生物的弹力和机械抗性，还参与控制细胞形状和行为的信号通路。这些发生变化的胶原蛋白表明，砷暴露破坏了许氏平鲉幼鱼体内经由细胞外基质的信号传导途径。钙离子是一种胞内的多功能信号，可以调控许多不同的细胞功能。本研究中，在低浓度砷暴露组（5 μg/L）中，钙离子单向转运蛋白出现显著上调，钙离子转运ATP 酶出现显著下调（表1）。此外，作为细胞膜内钙离子通道的亚型，电压依赖性L-型钙离子通道α亚基经高浓度砷暴露（50 μg/L）后出现显著性上调。这一系列蛋白的变化说明砷暴露会扰乱许氏平鲉幼鱼体内的钙离子平衡。G蛋白不仅参与信号传导，而且对于氧化应激反应也至关重要。G蛋白的显著变化表明砷暴露引起了细胞损伤。蛋白激酶CK1是真核生物中一类重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，可通过不同的信号传导路径有序的调节不同细胞过程。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和酪蛋白激酶属于蛋白磷酸酶家族，具有通过不同信号通路调节多种细胞过程的功能。经砷暴露后发现，蛋白激酶 CK1 和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的丰度分别在低浓度(5 μg/L)和高浓度(50 μg/L)砷暴露组中出现增加。此外，酪氨酸蛋白磷酸酶的丰度在高低浓度砷暴露组(5 μg/L和50 μg/L)中均增加。这些发生变化的蛋白证实砷暴露干扰了许氏平鲉幼鱼体内信号传导。
表1 砷暴露后(5 μg/L和50 μg/L) 许氏平鲉幼鱼体内的差异表达蛋白信息
在砷暴露组中共有8种与细胞骨架相关的蛋白发生了变化。角蛋白4在两个砷暴露组中均发生变化。其余7种蛋白（肌球蛋白轻链6、原肌球蛋白α-1 链、肌球蛋白轻链、肌间蛋白1a、肌球蛋白重链a、隔膜蛋白15和定位蛋白（肌动蛋白丝）肌肉Z线）仅在低浓度砷暴露组(5 μg/L)中发生变化。细胞骨架蛋白在细胞结构和胞内组织中起到核心作用，在三大主要细胞骨架网络中的任何一个网络中发生扰动，就可导致明显的病理学变化。金属和非金属成分能够导致海洋双壳类动物细胞骨架损伤，这一结论也在蛋白质组学研究中得到了证实。在海洋双壳类动物（蛤和牡蛎）体内，与细胞骨架损伤相关的差异表达蛋白通常包括肌动蛋白、微管蛋白和肌球蛋白轻链，而本研究发现在砷暴露后的许氏平鲉体内同样存在这些蛋白。因此，这 8 种与细胞骨架相关的蛋白质的变化表明，许氏平鲉幼鱼经砷暴露后体内细胞骨架出现了损伤。本研究在代谢组学和蛋白质水平上探究了环境相关浓度砷暴露(5 μg/L和50 μg/L)14 天对以许氏平鲉幼鱼的毒理学效应。图7中描述了砷暴露涉及的相关代谢路径。结合蛋白质组学和代谢组学分析结果来看，砷暴露能够显著影响许氏平鲉幼鱼体内的多种生物过程，如糖酵解、线粒体能量代谢、脂质和氨基酸代谢以及钙离子信号通路的调控等。尽管两个不同浓度砷暴露会导致许氏平鲉幼鱼体内出现相似的毒性效应，但从蛋白质组学和代谢组学变化来看，也存在明显差异。在低浓度砷暴露组(5 μg/L)中发现，发生变化的差异表达蛋白数目较多，这表明低浓度砷暴露(5 μg/L)可以激活许氏平鲉幼鱼体内的生理学反应，以适应不利环境。而高浓度砷暴露(50 μg/L)则使得许氏平鲉幼鱼在应激刺激下发生逃避。综上所述，本研究表明，借助于蛋白质组学和代谢组学相结合的分析方法，可以从分子水平上分析环境中的金属污染物对海洋生物的影响。
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