伊丽莎白女王一生中最有争议的事情，就是下令处死了苏格兰女王玛丽·斯图亚特。玛丽·斯图亚特是亨利七世的曾外孙女，1542年，刚出生不久的玛丽·斯图亚特在斯特灵城堡加冕为苏格兰女王。1558年，玛丽·斯图亚特嫁给了同龄的法国皇太子法兰西斯，即为法兰西斯二世。1560年，继位不到一年的法兰西斯突然暴毙，年仅18岁的玛丽·斯图亚特结束了在法国的生活，回到了苏格兰。
玛丽·斯图亚特同样是个有野心和权力欲的女人，她一回国就要求伊丽莎白指定她为王位继承人。伊丽莎白为了控制她，便建议她嫁给达德利勋爵。然而玛丽·斯图亚特并不理会她，所以两人互相敌对起来。1565年7月，玛丽·斯图亚特出人意料地嫁给了表兄亨利·斯图亚特·达恩利勋爵，因为亨利·斯图亚特·达恩利可以在伊丽莎白死后继承英格兰王位(条件是伊丽莎白没有后嗣)。
但婚后玛丽·斯图亚特就发现他的丈夫是个好色成性的浪子，一方面他喋喋不休地要求玛丽·斯图亚特赋予他“国王”的称号和实权，另一方面他大肆打击玛丽·斯图亚特女王的宠臣们，尤其是她的意大利籍秘书大卫·里奇奥，甚至还纠合苏格兰贵族当着她的面杀害了大卫·里奇奥。
这引起了玛丽·斯图亚特女王的仇恨。1567年2月，正在爱丁堡养病的亨利·斯图亚特·达恩利勋爵被离奇地掐死在花园里，人们认为这是玛丽·斯图亚特女王的情人博斯韦尔伯爵所为。但女王纠合了一群支持自己的贵族，组织了一次虚假的审判，结果是博斯韦尔伯爵本人无罪释放。
1567年5月，玛丽·斯图亚特和情人博斯韦尔伯爵结婚。这次不得人心的婚姻引起了苏格兰贵族们公开反对玛丽·斯图亚特女王的统治，不久贵族发生了叛乱，玛丽·斯图亚特女王被囚禁在列文湖畔的城堡里，并被迫将王位传给了她和亨利·斯图尔特·达恩利勋爵的儿子詹姆斯。
第二年，玛丽·斯图亚特从列文湖畔城堡逃了出去，她组织了几次未遂的军事政变，之后被迫逃到英格兰寻求她的表姑伊丽莎自一世的庇护，不料由于伊丽莎白记恨她曾经与自己争夺过王位，竟将她软禁在伦敦塔。
从这以后，玛丽·斯图亚特开始了漫长的被囚禁生活，有20年之久。然而在这期间反对新教的叛乱分子以玛丽·斯图亚特为精神领袖与王位继承人为借口，接连不断爆发了几次起义，让新教女王伊丽莎白一世惶恐不安。1587年2月，伊丽莎白女王下令处死玛丽·斯图亚特。传说刽子手事前没有把斧子磨得锋利，以至于第一次砍下去之后脖子没有完全断裂，血流如注。刽子手把玛丽·斯图亚特冷峻的头颅展示给众人的时候，人们惊愕地发现她的嘴还在蠕动。
这在当时引起了强烈的轰动，玛丽·斯图亚特毕竟是苏格兰的女王，处死一位外国君主在当时是极其罕见而又令人震惊的一件事情。后来伊丽莎白一世也自知理亏，竟将此事归罪于手下的官员。
一个女人需要有多么强悍的手腕才可以统治一个国家多年不倒，在她统治的几近半个世纪中，英国不但走出了贫穷衰落的境地，而且经济不断发展，国内政局稳定统一，一跃成为欧洲强国之一。然而在这个不可复制的女人身上依然有着普通女人的痛苦、对爱的渴望和不能控制的无助，这才是这个不可一世的女人真正具有魅力之处。
1603年3月23日伊丽莎白一世在伦敦去世。她终身未婚无嗣，由苏格兰国王詹姆士·斯图亚特继位，都铎王朝从此被斯图亚特王朝取代。
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