兔单克隆抗体的制备与应用

单克隆抗体技术起源于Kohler等创建的体外鼠源杂交瘤技术。经多年研究，鼠单抗已从单纯的生物实验室科研及临床诊断发展到治疗性抗体药物。但鼠单抗的主要缺陷是小鼠免疫系统不能识别某些免疫原，尤其是鼠源性的免疫原，而且鼠单抗的亲和性不如兔来源抗体的亲和性高。然而由于没有发现兔源性的浆细胞瘤及病毒体外转染兔B细胞的技术困难，直到1995年，Spieker-Polet等。在c-myc/v-abl转基因兔身上成功地获得了兔浆细胞瘤细胞系，得到了稳定的兔-兔杂交瘤，才使兔单克隆抗体技术有了突破性进展。近年兔单克隆抗体技术日臻完善，目前商品化的兔单抗已达数千种。本文综述了当前兔单克隆抗体技术的发展进程、技术优势以及兔单克隆抗体技术在基础研究、临床诊断和治疗方面的应用前景。
兔的免疫反应机制

兔对外源蛋白质能产生强烈的免疫反应，在众多免疫学实验中兔多克隆抗体已得到广泛应用，尤其当所涉及的抗原是鼠源蛋白质或在鼠体内不能引起免疫反应时，兔抗体的作用就显得愈发重要了。上世纪90年代，Knight通过转基因手段，开发了一种新型的兔淋巴瘤细胞240E-1，用来制作兔杂交瘤细胞，得到兔单克隆抗体。美国Epitomics公司继续改进了此项技术，使之发展为成熟的兔单抗技术，并由此开发了多种高亲和力抗体，广泛用于基础研究、临床诊断乃至治疗性药物等领域。
与大多数哺乳动物一样，兔的免疫反应是由一系列复杂的抗原、抗原递程细胞（antigen presenting cells,APC）、T细胞以及B细胞相互作用形成的。经历初次免疫后，元B细胞被刺激分化成分泌抗体的浆细胞；大多数蛋白质抗原，在初次免疫后5天内血清中最先出现的特异性抗体多是IgM；初次免疫反应后，在特定细胞因子以及T细胞共同作用下，B细胞开始分泌IgG；血清中的抗体滴度2周左右达到最高，然后缓慢下降。如果采用多次免疫，血清中的抗体滴度会快速上升。兔抗体根据重链的不同可以分为IgG、IgM、IgA、IgE以及IgD5种类别。兔血清内含量最高的抗体是IgG，浓度5～20 mg/mL，其次是IgA，浓度3～4mg/mL。与小鼠及人类的IgG不同，兔IgG未发现亚型，结构也稍有不同。其在重链的N端及D-E环处的氨基酸数目比较少，在重链的可变区还常存在二硫键。兔抗体轻链亚型中仅有5 % ～1 0 % 为λ 亚型，而90%～95%为Cκ1，且有5种等位基因，分别编码b4，b4v,b5，b6以及b9这5个抗体轻链异型。在Cκ1轻链的可变区和恒定区之间也发现有二硫键的存在，该二硫键可能与兔抗体良好的稳定性以及较长的半衰期有关。
大多数哺乳动物的抗体形成机制都是通过抗体基因序列(V, D,J)重排，再经过体细胞突变达到亲和力成熟。而兔抗体的过程稍有不同，以重链的VDJ基因重排为例，兔抗体的VH基因序列有80%以上相似，且只有一种VH1亚型；而JH基因亚型，JH4的使用频率大约为80%，另外20%为JH2，另外3种亚型则很少出现；在12种D基因亚型中，只有D2a(D9)常见，其余的亚型非常罕见。这种VDJ重排的局限性造成了兔抗体多样性有限，所以兔免疫系统需更频繁、更主动地进行体细胞基因突变以形成足够的抗体多样性。

兔单克隆抗体的发展过程
自从建立了鼠单克隆抗体技术，人们尝试过很多用杂交瘤技术产生兔单抗，但是由于缺少兔骨髓瘤细胞系，用异源骨髓瘤融合得到的兔-鼠杂交瘤细胞有不稳定性和不能长期分泌抗体等问题。
Knight等在一只转基因兔上过量表达v-abl和c-myc两种癌基因c，并分别置于在重链和轻链的增强子下游，最终从转基因兔上得到了骨髓瘤样肿瘤，并从中分离得到了一株骨髓瘤细胞系，命名为240E-1。用这株240E-1细胞与兔B淋巴细胞融合得到的杂交瘤能分泌兔单克隆抗体。这是首次通过兔-兔杂交瘤的方式得到兔单克隆抗体。但与早期鼠骨髓瘤细胞系一样，240E-1细胞也存在两个最主要问题：首先是不稳定，经过数次传代或亚克隆后杂交瘤逐渐失去分泌抗体的能力；其次，细胞株本身会表达内源性的兔IgG。为了解决稳定性问题，Zhu等[22]改进了培养基的方法，并采用重复亚克隆技术，通过11轮亚克隆和筛选，得到一株新细胞株，命名为240E-W。染色体分型实验证明它的染色体数目更稳定，有79至90对（平均84对），与240E-1的44至70对染色体（平均60对）相比，240E-W更稳定。DNA指纹图谱以及基因表达谱分析也证明这两株细胞存在巨大差异。用240E-W制作融合细胞株，得到的杂交瘤细胞融合效率更高也更稳定。为了解决内源性IgG的问题，Huang等又从240E-W细胞的杂交瘤中得到一株不带有内源IgG重链基因的细胞株，命名为240E-W2。通过各种大量融合实验证明，利用240E-W2融合得到的杂交瘤细胞不会表达可检测到的内源性IgG重链，并提高了融合效率以及杂交瘤阳性率。

兔单克隆抗体的优势
3.1 高亲和力
通常用解离系数(kd)描述抗体和抗原之间的结合强度，即亲和力。对于抗体药物来说，一般认为达到纳摩尔 (nanomolar,10-9mol/L)级的解离系数就有高亲和力（对于大多数治疗用抗体其解离系数均要求达到纳摩尔或者亚纳摩尔级，kd=10-9~10-10mol/L)。如前所述，兔单抗的高亲和力与其独特的免疫亲和成熟过程有关，因此兔单克隆抗体具有相当高的亲和力，其解离系数甚至可达到皮摩尔级(kd=10-12 mol/L)。这种高亲和力使得兔单抗在开发更灵敏的检测试剂以及更有效的药物方面具有巨大的应用潜力。
3.2 高特异性和低本底
兔单抗具有非常强的结合特异性。通过蛋白质印迹(Westernblot)实验研究大约1000个不同的兔单抗发现，大多数兔单抗能特异性地与目标蛋白条带结合。这种高特异性亦已被免疫组织化学实验进一步证实。与小鼠单抗相比，对相同的目标蛋白，兔单抗能得到更清晰的免疫组化图像，并且使石蜡切片上的背景染色大大降低。Rossi等应用兔单抗对肿瘤和正常组织切片上的雌激素受体、黄体酮受体、Ki-67、cyclinD1、CD3、CD5、CD23以及synaptophysin等靶标进行免疫组化染色后，发现兔单抗能在不降低特异性的前提下，提高检测的灵敏度。
3.3 可识别更多新型表位
人纤维粘连蛋白免疫实验表明，与小鼠抗体相比，兔抗体能识别更多的表位：同时使数只小鼠和兔免疫，一定时间后取血，计算经蛋白酶消化后的人纤维粘连蛋白免疫印迹显示的条带数，发现兔抗体能识别更多的蛋白条带。利用兔特异性抗体会增加对于某些特殊抗原表位的识别能力，例如磷酸化位点以及其他转译后修饰的蛋白位点。利用兔单克隆抗体的这一特点可进行药物作用机理研究。
3.4 杂交瘤克隆数更多
在药物筛选中，通常需要非常庞大的化合物库才能得到足够的候选药物，杂交瘤抗体药物的筛选也是这样。克隆杂交瘤可用小鼠和兔，兔和小鼠相比脾脏更大，可以融合的B淋巴细胞数量是小鼠的近50倍，因此每一次融合，能得到比小鼠多数倍的杂交瘤克隆[26]。此外，研究发现兔杂交瘤细胞还较适于高密度培养，细胞传代的间隔时间与小鼠杂交瘤相比可以相应缩短。因此可用兔杂交瘤技术取代鼠杂交瘤技术来筛选抗体药物。
3.5 识别鼠源蛋白抗体
研究者常使用啮齿类动物作为研究人类疾病的动物模型，并使用这些动物模型测试候选药物的治疗效果。目前科研最常用的动物是小鼠和大鼠。但是，鼠源抗体作为候选药物往往不能识别模型中的鼠源蛋白，要解决这个问题，必须从某种异源动物得到相应“替代抗体”用作动物模型的研究。例如，使用大鼠抗体作为小鼠抗体的“替代抗体”，反之亦然。可是“替代抗体”与候选治疗性抗体本身往往有很大差别，亲和力不同，甚至识别表位也不同。而应用兔单抗可解决这一问题。通过识别人和鼠源蛋白的共有表位，兔单抗可同时结合人和鼠源蛋白，也省去了制造“替代抗体”的步骤。
兔单克隆抗体的应用
4.1 在生物标记物开发中的应用
兔单克隆抗体广泛用于生命科学研究的各个领域[28-31]，尤其在免疫组织化学以及检测蛋白的转译后修饰方面具有独特优势。至今已有100多种兔单克隆抗体开发用于癌症的IHC临床诊断与研究，其中最具代表性的就是Her2和c-Kit的IHC诊断试剂盒。在蛋白修饰研究领域，如蛋白的磷酸化，在与疾病相关的蛋白质信号通路中起到了至关重要的作用，使用磷酸化蛋白的兔单克隆抗体可以非常清楚地显示蛋白的磷酸化程度。目前已有200多种磷酸化特异性的兔单克隆抗体面世。
4.2 在治疗抗体药物开发中的应用
临床使用的大多数治疗用抗体均需经体外亲和力成熟这一步骤，以提高抗体的亲和力。这一过程常需8至12个月，最终亲和力在纳摩尔级(10-9mol/L)。兔单抗不需使用体外亲和力成熟，就能达到10-11至10-13mol/L。这种高亲和力不仅减少抗体的临床使用量，还能减少由于使用大量抗体带来的副作用。但这种高亲和力的优势还需在动物和临床试验中进一步证实。另外，与鼠单抗的人源化相比，兔单克隆抗体的人源化更容易。因为，兔单克隆抗体主要由一种重链及轻链基因构成，通过分析大量的兔单克隆抗体序列发现，兔与人的抗体同源性更高，约60%～76%，而小鼠与人的抗体同源性略低，为57%～72%，说明用兔单克隆抗体开发药物前景更广阔。
结语
兔单克隆抗体的优势为生物医学研究和抗体药物的发展提供了大的空间。由于寻找特异性抗原困难，技术上的高壁垒使得单抗治疗性药物在专利保护到期后也不易被仿制，也不易受通用名药品价格的威胁。进一步开发兔单克隆抗体有望获得更灵敏、更可靠的诊断试剂和高质量的抗体药物。
经多年研究，兔单克隆抗体在免疫印迹、免疫组化、流式细胞分析及其他免疫学研究中得到了越来越多的应用。除了首先获得兔杂交瘤专利的美国Epitomics公司，还有其他公司也在开发自己的兔单克隆抗体产品，如美国CellSignalingTechnology公司。由于兔抗体的高亲和力，高特异性并且易于人源化，在治疗用抗体以及临床诊断领域也正逐渐得到重视。我国国内有两家公司均已与美国公司达成合作协议，将致力于开发兔单克隆抗体药物。