如果说NAD+的疑云密布在补充方式、前体的酶解与转化效率上，二甲双胍这个问世80余年的老药，出人意料地，连起效机制都还未明晰。我们曾对二甲双胍作用机制进行阶段性小结，大部分观点同意二甲双胍主要健康益处与AMPK激活有关，但是具体怎么激活AMPK？没人说得准。
二甲双胍激活AMPK之谜
简单罗列一下AMPK的激活原理，AMPK由α、β、γ三大亚基构成，每个亚基又分为多个结构域。最经典的AMPK激活方式是：当细胞内AMP增多时， LKB1（肝激酶 B1）被激活，它可以直接磷酸化AMPK的α亚基Thr172位点（苏氨酸172），激活AMPK；AMP增多也可通过直接结合γ亚基CBS区域变构激活AMPK。
图注：AMPK结构示意图
除该经典方式，AMPK还有以下几种活化方式：
①ADaM位点可被水杨酸盐或一些人造化合物激活，从而轻微上调AMPK活性（见上右图ADaM位点）；
②在基因损伤压力下，细胞中钙离子增高，可通过CaMKK2信号活化AMPK；
③细胞葡萄糖不足时，醛缩酶Aldolase引发溶酶体表面V-ATPase变构，又刺激到LKB1与AMPK接触，从而使Thr172磷酸化、AMPK活化。
二甲双胍通过上述哪种方式激活AMPK？
2000-2010年若干论文声援了“二甲升高AMP，走最经典激活通路”的说法，使其成为主流猜想。就既有研究结论看，动物实验需按照240mg/kg大剂量给药，才会抑制呼吸链复合体I、减少ATP。虽然即使人类每天口服1.5-2.0g二甲双胍，其引发的血药浓度最大值波动在5-30μM，远低于240mg/kg动物给药的125-150μM，但仍有不少抗衰老爱好者担心每天口服二甲双胍会损伤线粒体、得不偿失。
图注：线粒体氧化呼吸（来源：cusabio.com）
上周，“吃胍”群众们的心总算被厦门大学林圣彩院士发表于Nature正刊的论文安抚放下了。在人人都想来片二甲延寿的今天，本文可谓正能量满满：首次以常规口服剂量二甲双胍作研究对象，深入揭秘起效原理，低剂量二甲双胍只在细胞内小规模激活AMPK，不干扰ATP生成，且仍发挥降糖、减脂、抗衰益处。
低剂量二甲双胍激活AMPK，
但不抑制ATP
研究伊始，林圣彩团队首先自证口服“临床二甲双胍治疗剂量”的吸收情况。他给予临床受试者500mg格华止®️缓释片（派派掐指一算，这是读者朋友们相对容易接受的剂量），定点抽血测定受试者体内的药物浓度，发现口服格华止3小时即可在血液中达到药物浓度峰值（差不多4μM），12小时又逐渐趋于平静。
图注：服用500mg格华止缓释片后人体血药浓度变化
接下来，研究团队在离体细胞模拟500mg格华止®️给药，正式进入低剂量二甲双胍作用机制的勘测之旅。他们用5μM二甲双胍“浸泡”哺乳动物肝原代细胞（可理解为“从肝脏直接取下的新鲜细胞”），果不其然，肝细胞的AMPK在用药2小时起就被激活（下图左），但细胞内ATP、AMP、ADP比值却无明显变化（下图右），这与大剂量给药截然不同。此外他们还观察到一个有趣现象：细胞溶酶体发生了脱羧反应，这暗示低剂量二甲双胍起效很可能与溶酶体有关。
图注：细胞内的溶酶体
脱羧反应常发生于体系pH升高时，这使研究人员将目光投向溶酶体表面名为V-ATPase质子泵，它负责将溶酶体pH维持在4.5到6.5。经验证，低剂量二甲双胍处理溶酶体仅需1小时，V-ATPase的活性就大幅下降(下图左)，其质子交换能力也被抑制（下图右）。
图注：（+）表示使用二甲双胍，
（-）表示未使用二甲双胍
发现二甲双胍全新靶蛋白PEN2
二甲双胍抑制溶酶体ATPase在先，激活AMPK在后，三者如何在给药后互相“接头”？
研究团队设计了一种二甲双胍“探针”MET-P1，它可像钓鱼一样钓出与二甲双胍结合的蛋白。既然二甲双胍激活AMPK得经过溶酶体，那就把钓鱼范围锁定在溶酶体。在纯化溶酶体内所有蛋白提取物后，探针从中薅出了113种蛋白；使用慢病毒介导的shRNA让这100多种蛋白质“消失”，发现当缺失了名为PEN2的蛋白，二甲双胍就不能再抑制溶酶体V-ATPase活性，AMPK也无法随之激活。
图注：MET-P1探针在纯化的溶酶体蛋白中“钓鱼”
PEN2就是低剂量二甲双胍激活AMPK的必备蛋白，通过进一步质谱分析，发现二甲与PEN2的准确结合位置在PEN2的F35、E40位点。
至此，全新的二甲双胍靶蛋白被发现了。
PEN2到底是什么东西？
PEN2（早老素增强因子-2），是γ-分泌酶复合物的一个基团，日常参与的工作可谓“如雷贯耳”、“令人发指”：将名为APP的淀粉样前体蛋白催化水解为Aβ淀粉样蛋白，助推老年痴呆发生发展。
图注：γ分泌酶是跨膜蛋白，
PEN2（红）为一个组成部分
这么看来，“接应”二甲双胍不是PEN2的天性，大概只能算“兼职”。
低剂量二甲双胍激活AMPK，
竟与葡萄糖饥饿“殊途同归”
发现低剂量二甲双胍的全新靶蛋白已经令人兴奋，为厘清AMPK活化前每一个步骤，研究团队继续深挖溶酶体V-ATPase如何被“二甲双胍、PEN2”组合影响。通过质谱分析等技术，筛选出123种与PEN2发生关系、常驻溶酶体中的蛋白，最终成功锁定V-ATPase的辅助蛋白ATP6AP1，它的420-440氨基酸残基正是与PEN2与V-ATPase结合的位点。
至此我们获得的结论是：低剂量二甲双胍与PEN2结合，二者一起募集到溶酶体V-ATPase复合体的ATP6AP1蛋白上，即可导致V-ATPase空间构象发生改变，V-ATPase活性被抑制。
图注：PEN2与ATP6AP1结合
（红色虚线圈出结合位点）
V-ATPase活性被抑制，最终为何轮到AMPK被激活？
在溶酶体表面，V-ATPase质子泵与名为Ragulator的蛋白结合在一起，共负责感应细胞内营养、能量短缺或充足。当营养充足时，V-ATPase活性良好，呈下图左“盛开模样”，这种空间构象有助于mTORC1复合体募集Ragulator，激活mTOR信号，让细胞进行合成代谢；当能量短缺时，V-ATPase活性被抑制，呈下图右“收缩模样”，这种空间构象有利于把LKB1募集到溶酶体膜，接触并激活AMPK，让细胞进行分解代谢。
图注：V-ATPase与Ragulator在溶酶体表面调控AMPK、mTOR。为方便阅读，本推文不格外对溶酶体(lysosome)/内体（endosome）作区分
因为V-ATPase-Ragulator感应器周围的“空间有限”,mTOR、LKB1只能有一种“落座”，这注定了AMPK、mTOR当下的活化/抑制状态是对立的。研究团队对低剂量二甲双胍→PEN2→ ATP6AP1→V-ATPase → Ragulator → LKB1 → AMPK进行环环验证，也确认二甲就是借用PEN2这个“中介”搭上了溶酶体活化AMPK、抑制mTOR的列车。
林院士通过探索二甲双胍作用机制，引出了AMPK活化的全新分支路径。看到这里的朋友或许可以回头看本文开头，AMPK活化机制中“葡萄糖饥饿”也是经过V-ATPase→Ragulator→LKB1→AMPK来调控AMPK、mTOR活性——这条溶酶体激活路径并不是某种物质专属，是一条进化保守的代谢调节路径，更可能是AMPK很青睐的激活路径（而不是“备胎”）。
令人敬佩的是，这条正变得越来越“经典”的AMPK活化路径，也是林院士团队发现的。相关研究最早于2014年发表于Cell Metabolism杂志，彼时破除了人们 “葡萄糖不足则ATP不足，从而由AMP经典通路激活AMPK”的猜测，不仅被评为2017年度“中国生命科学十大进展”，“V-ATPase→Ragulator→LKB1→调控AMPK、mTOR活性”甚至被国际学者命名为“林通路”。
图注：二甲双胍、葡萄糖饥饿均共享“林通路”激活AMPK
至此我们对低剂量二甲双胍起效机制进行小结：低剂量二甲双胍，享有全新靶蛋白PEN2，在PEN2的帮助下进入“林通路”激活AMPK，该过程而不需要抑制ATP生成；且与葡萄糖饥饿、热量限制“殊途同归”。
论文正文分享到此告一段落，细细回味方才察觉其中正能量。
首先，它平息了常规口服剂量二甲双胍激活AMPK的原理争议，不仅排除了损伤ATP合成的忧患，甚至找到了全新靶蛋白PEN2，毋庸置疑是一项伟大的开创工作。
其次，二甲双胍经PEN2汇入“林通路”，也从深层论证了“二甲双胍是优秀的热量限制模拟物”这一观点，AMPK激活剂有很多，想必二甲双胍正是因对热量限制的高度模拟特性，才能在健康功效上冠绝群雄吧。
再者，我们不得不感叹本文用心之良苦，全文围绕“低剂量”，而该剂量的设定（约等于口服500mg格华止®️），对时光派读者而言可谓非常“贴心”。
最后，PEN2的发现有助于人们开发二甲双胍的更优替代品。二甲双胍需要OCT蛋白转运入胞，然而OCT蛋白仅在肝脏、小肠、肾脏富集，因此“神药”药效很大程度被局限于这些脏器中。如能筛选或从头合成瞄准PEN2、ATP6AP1蛋白的新分子，则有望开发新的、靶器官更广泛的AMPK激活剂，做出全身逆龄的“强效不老药”。
距离论文发表已经过去几天，不少平台都进行了搬运与点评，但时光派还是想与各位读者分享自己阅读此文时的激动心情。我们想对所有攻坚衰老与抗衰老机制的伟大学者致敬，做别人难以做到的深度研究，或许需要更辛勤的工作、耗费更长时间，但无疑也会给全人类带来更大的进步和希望！
作为重要的调节寿命信号通路，AMPK通路如何构成？对机体稳态作用几何，我们该如何去科学调控？
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参考文献
[1] El-Mir, M. Y. et al. Dimethylbiguanide inhibits cell respiration via an indirect effect targeted on the respiratory chain complex I. J. Biol. Chem. 275, 223-228 (2000).
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[3] Hawley, S. A. et al. Use of cells expressing γ subunit variants to identify diverse mechanisms of AMPK activation. Cell Metab. 11, 554-565 (2010). [4] Zhang, C. S. et al. Fructose-1,6-bisphosphate and aldolase mediate glucose sensing by AMPK. Nature 548, 112-116 (2017).
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