Nature | “神药”二甲双胍靶点新发现

2023-03-09 07:50·医学顾事

近期发表在Nature上的文章，文章题目是Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2。

“神药”二甲双胍作为2型糖尿病患者降血糖的一线药物，除抗糖尿病效果显著外，近年来还发现其具有降低肝脏脂肪、抗衰老和抗肿瘤等作用，引起了研究者的广泛关注。然而目前二甲双胍的直接作用靶点仍不清楚。作者前期研究发现，小鼠大剂量口服二甲双胍(≥ 250 mg/kg)通过抑制线粒体呼吸链复合物I，增加AMP/ATP和ADP/ATP比率，影响ATP合成，从而激活AMPK。此时小鼠血浆浓度峰值为125-150 μM。而患者每天服用标准临床剂量的二甲双胍(1.5-2 g)，血浆浓度仅为5-30 μM，尽管不足以增加AMP/ATP和ADP/ATP比率，但依旧能激活AMPK。因此本文作者针对这一有趣现象，研究临床剂量的二甲双胍激活AMPK的靶点和机制。

首先，作者发现临床剂量的二甲双胍能抑制溶酶体v-ATPase；且低剂量的二甲双胍能降低小鼠肝原代细胞中溶酶体酸度，在不影响AMP/ADP比率的情况下，增加p-AMPKα和p-ACC的表达，激活AMPK通路。

图1 低浓度二甲双胍激活AMPK而不增加AMP/ADP水平

作者进一步合成了光亲和二甲双胍探针Met-P1和Met-P2，只有Met-P1具有与二甲双胍相同活性。将Met-P1与纯化的溶酶体裂解液孵育，并紫外照射，用Biotin-Avidin亲和纯化与Met-P1结合的蛋白，之后进行质谱(MS)分析。通过多种方法验证，作者鉴定出PEN2，一种γ-分泌酶的亚基，能被Met-P1探针捕获。且在原代肝细胞、MEF和HEK293T细胞中敲低PEN2，能阻断低剂量二甲双胍诱导的AMPK活化和v-ATPase抑制。荧光共定位和电镜显示，PEN2定位于溶酶体中。等温量热法(ITC)和表面等离子共振(SPR)测定Met-P1与PEN2结合KD值为1.7 µM和0.15 µM。对其结合位点研究发现PEN2中F35和E40突变(PEN2-2A)后无法与二甲双胍相互作用。结果进一步说明二甲双胍的直接结合靶标为PEN2。

图2 PEN2与二甲双胍结合，是低剂量二甲双胍诱导的AMPK激活所必需的。

作者接下来研究了低剂量二甲双胍结合PEN2后如何抑制v-ATPase和AMPK激活。通过免疫共沉淀结合质谱鉴定，作者找到了PEN2的互作蛋白ATP6AP1，一种v-ATPase的辅助因子。ATP6AP1Δ420-440突变或PEN220A突变均削弱了PEN2和ATP6AP1之间的相互作用，且阻断了二甲双胍诱导的v-ATPase抑制和AMPK激活。单独ATP6AP1不与Met-P1结合。

作者先前的研究报道，葡萄糖剥夺也能激活溶酶体AMPK，不增加AMP/ADP比率，其主要通过调节果糖-1,6-二磷酸传感器醛缩酶下游的v-ATPase、Ragulator和AXIN。因此，作者在肝脏、MEFs和HEK293T细胞中敲除 AXIN, LAMTOR1(Ragulator的一个亚基)和ATP6VoC(v-ATPase的VoC亚基)，发现能阻断低剂量二甲双胍对AMPK的激活。因此，低剂量二甲双胍结合PEN2后，促进PEN2连接至v-ATPase亚基ATP6AP1，作为上游信号，进而引发溶酶体AXIN和LKB1易位至溶酶体表面，以磷酸化和激活AMPK。

图3 ATP6AP1将PEN2连接到v-ATPase以激活AMPK

作者最后研究了体内PEN2和ATP6AP1如何介导二甲双胍的作用。在PEN2-IKO小鼠(肠道特异性耗竭PEN2)中，二甲双胍的餐后降糖作用受损，且不能促进GLP-1和胰岛素分泌。PEN2-LKO小鼠(肝脏特异性耗竭PEN2)，小鼠肝脏中AMPK的激活受到严重损害，且不能降低肝脏甘油三酯(TAG)水平。在线虫中敲除PEN2和ATP6AP1，阻断了二甲双胍诱导线虫寿命增加。因此，PEN2与ATP6AP1的结合对二甲双胍降低葡萄糖水平、降低肝脏脂肪含量和延长寿命具有重要作用。

图4 PEN2 和 ATP6AP1的结合介导二甲双胍的有益作用

总而言之，作者确定PEN2是二甲双胍的直接作用靶标。二甲双胍结合PEN2后，PEN2与ATP6AP1相互作用并抑制v-ATPase的活性，激活溶酶体AMPK，而不增加AMP/ADP比率。PEN2-ATP6AP1轴是二甲双胍降低餐后血糖、减少肝脏脂肪和寿命延长所必须的，也可作为潜在靶点为筛选二甲双胍替代品提供一定思路。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04431-8

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