一、CRISPR/Cas9系统的工作原理
CRISPR系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，其中以二类CRISPR系统即CRISPR/Cas9最为经典常用。此系统的工作原理是 crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA（之后被人工合成的sgRNA 所替代）复合物，此复合引导Cas9蛋白定位到基因组上PAM基序的5’端上游切割DNA，造成双链断裂，同时激活机体内两种不同的修复机制NHEJ和HDR，最终造成基因组的改变（如图1所示）。
图1. CRISPR/Cas9 系统工作原理[1]
二、CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术与传统的基因沉默技术对比
纵观基因编辑的发展史，CRISPR/Cas9是继ES 细胞打靶、ZFN和TALEN技术后可用于定点构建基因敲除模型的第三代基因编辑方法，它具有无可比拟的优势，不仅可以快速、准确对大小鼠及其他物种进行遗传改造，更是建立基因敲除细胞系的有效工具。
关于基因编辑构建大小鼠模型，往期我们已经详细介绍过（文末有链接列表），本期就一起学习如何在细胞系进行基因敲除的操作？
三、基因敲除方案的设计原理
简单来说就是，根据实验目的选择合适的靶向位点，一般选择外显子区，优先破坏重要的功能域。以K-ras基因为例（如下图2所示）：
在4号外显子上设计靶点，将含有Cas9和sgRNA 的质粒转入细胞后，质粒编码的Cas9蛋白和特异靶向性的sgRNA结合，识别PAM基序，切割sgRNA靶向区，使K-ras基因在4号外显子上产生DNA双链断裂，进而诱导细胞内产生内源性DNA双链断裂修复机制，即高概率的非同源末端连接修复机制（NHEJ）和低概率的同源重组修复机制（HDR）。随机修复过程会使切口部位发生随机插入或缺失（InDel），当变异类型为移码突变时，编码氨基酸排列发生变化，最终可能导致蛋白功能丧失，细胞基因被成功敲除。最终可以形成不同类型的基因敲除细胞，经过后序的筛选即可得到适用的单克隆基因敲除细胞株。
图2. 利用CRISPR/Cas9系统构建K-ras基因敲除细胞株
四、基因敲除细胞株构建流程
查找目的序列：在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3627）上，下载靶基因的序列信息，也可以根据基因名称或者基因ID在ENSEMBLE中进行查找分析；
设计sgRNA：确定打靶位点后，在线（http://crispr.mit.edu/）免费设计sgRNA，优先选择低脱靶率的作为基因敲除的靶点，然后根据靶点设计sgRNA oligo F/R；
退火：将sgRNA oligo放入PCR仪中95℃进行退火，5min后自然降温形成互补双链；
酶切：用限制性内切酶Bbs I酶切PX458或PX459敲除质粒，琼脂糖凝胶电泳验证酶切效果并回收酶切后的质粒待用；
连接 ：用T4连接酶将退火后的双链oligo连接到PX458或PX459敲除质粒上；
转化：将步骤5中连接产物转入DH5α感受态细菌中，并涂布氨苄抗性的LB平板；
测序：挑选单克隆送测，选择正确的质粒扩增后待用；
转染：将待敲除的细胞铺板于6孔板中，当细胞密度约80~90%时进行转染；
流式细胞仪分选：PX458质粒带有EGFP荧光报告基因，转染48h后观察荧光效率并用胰酶消化收集细胞，可用流式细胞仪分选得到阳性细胞群，然后利用96孔板无限稀释法，将阳性单克隆细胞接种至96孔板中培养（注新款BD流式机型是可以直接把分选到的细胞点到96孔板里的，所以可不用无限稀释法，只说流式分选就好）。PX459质粒带有嘌呤霉素抗性基因，转染6h后可更换为含有嘌呤霉素的完全培养基压力筛选，48h后用胰酶消化孔内存活的细胞，以1细胞/孔的密度接种于96孔板中培养。
扩增培养：细胞克隆长满96孔板后转入48孔板中扩增培养；
细胞株鉴定：细胞长满48孔板后胰酶消化，可以从三个层面对基因敲除细胞株进行验证：①提取细胞基因组PCR扩增，进行单克隆测序分析；②提取RNA，QPCR扩增，进行mRNA检测；③提取蛋白，以验证敲除细胞中目的蛋白的表达情况。
图3. 利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除细胞株的流程
五、常见Q＆A
1. 细胞转染效率低，流式分选不到阳性细胞？
支原体污染会降低细胞的转染效率，另外转染试剂和细胞种类也是影响细胞转染效率的主要因素。
2. 为什么铺到96孔板里的细胞，有时会生长缓慢，有些甚至会出现细胞死亡的现象？
在开始研究蛋白功能之前，最好先查阅相关参考文献，明确目的蛋白的编码基因敲除后会不会对细胞的生长增殖产生影响。有些基因敲除会抑制细胞的生长，有些则对细胞有致死作用，给实验造成困难，所以磨刀不误砍柴工，相关文献资料的查阅是很有必要的。
3. 加速细胞克隆长成的窍门有哪些？
可以尝试增加培养基中的血清浓度，或换用胎牛血清、ES血清；给培养基中加入刺激因子；在铺板96孔前先铺一层滋养层细胞进行培养等。
4. 为什么有时候做基因型鉴定时，PCR扩增不出目的条带？
在做敲除前，最好对细胞进行STR鉴定（尤其是非官方来源的细胞），确定实验用的细胞是自己要用的细胞。在排除了细胞问题后，可以通过设置温度梯度、加入DMSO、换用高保真酶、更换引物等方法来优化PCR条件。
5. 为什么有些细胞基因敲除后在DNA水平上可以检测到突变，而蛋白水平（Western blot）变化不明显？
基因组只有发生移码突变时突变位点后的编码氨基酸才会大范围改变，进而引起蛋白正常结构和功能的丧失，因此可以多筛选几株敲除细胞株进行western检测；不同克隆号的抗体氨基酸识别位点可能不同，western检测前应详细阅读抗体说明书，查明其识别氨基酸位点，避免假阴性结果出现，也可结合后期蛋白功能实验验证敲除效果。
参考文献
1. Shao Y, Guan Y, Wang L, et al. CRISPR/Cas-mediated genome editing in therat via direct injection of one-cell embryos.[J]. Nature Protocols, 2014, 9(10):2493.
2. Cong L, Zhang F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.[M]//Chromosomal Mutagenesis. Springer New York, 2015:815.
3. Joung K J, Kleinstiver B, Pattanayak V. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases:, US9512446[P]. 2016.
关注（360图书馆：科研小助手），获得更多科研小技巧
联系客服
