人血浆中富含包括IgA、IgM和IgG抗体在内的多种抗体,其中以IgG抗体为主。通过物理分离的方法，我们可从血浆中得到浓缩的抗体，即静脉注射用免疫球蛋白(IVIG)。而IVIG中含有少量的天然自身抗体(natural autoantibody)。
天然自身抗体(natural autoantibody)，由B1细胞于机体外部刺激以前分泌产生的，具有低特异性、低亲和性等特点。研究表明利用特定的抗原筛选出的抗肿瘤天然自身抗体，能有效抑制肿瘤的生长和转移。据悉研究者使用特定的抗原，从人血浆抗体中筛选出抗VEGFR1/F2天然自身抗体混合物，以此用于治疗肝癌患者。而这项研究目前已进入临床试验阶段。
多抗体联用已用于治疗具有多靶点的肿瘤疾病，或抗原异质性的病毒或细菌感染类疾病领域中。与传统的多药联用策略不同，Oligoclona是通过平行生产单一组分后混合，或以“单罐”生产的方式，将联用的单克隆抗体以一定的比例混合成一个药物以供患者使用。
下面将分别介绍IVIG、Natural Autoantibody和Oligoclonal的研究现状及发展趋势， 并对三者进行比较分析。
1
IVIG的研究和使用情况
静脉注射免疫球蛋白，是将数百个正常人免疫球蛋白混合而制备的免疫制剂。其有广谱抗病毒、细菌或其他病原体的IgG抗体，是一种多克隆免疫球蛋白。免疫球蛋白与抗体形成的复杂免疫网络，具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用。受试者在静脉注射IVIG后，血液中的IgG水平迅速提高，机体的抗感染能力和免疫调节功能增强。
FDA和EMA批准IVIG：低剂量使用，适用于抗体不足的人群以及继发性低毒血症和复发性细菌感染的治疗。高剂量使用，适用于自身免疫疾病和感染，包括特发性血小板减少性紫癜、川崎病、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病和多灶性运动神经病。此外，临床上IVIG可超适应症使用，可应用于70多种不同的疾病，在血液病、皮肤病、神经肌肉疾病中的使用最多，占使用量的33%。
IVIG通过与体内Fc受体结合，激活ADCC和CDCC效应杀伤细胞， 也可通过激活巨噬细胞，产生促炎反应，进一步激活杀菌、破坏肿瘤细胞和组织损伤的信号。静脉注射人免疫球蛋(IVIG)，广泛作为炎性病理的一种免疫调节策略，被认为有促进癌症细胞调亡的作用。肿瘤的发展取决于它们改变肿瘤相关巨噬细胞极化状态(从M1/免疫原性的/促炎性的转变为M2/抗炎性的)的能力。体外研究表明，IVIG抑制M1巨噬细胞产生促炎性细胞因子，并介导人和鼠的M2巨噬细胞从M2到M1的极化转变[1,2]。体内研究表明，IVIG通过一种Fcεr1γ 依赖性链的方式修饰肿瘤相关的骨髓细胞的极化，调节肿瘤动物中的血液的细胞因子水平，通过FcγRIII (CD16), FcγRIV和FcRγ 汇聚进行抑制肿瘤的发展，后两种影响属于巨噬细胞介导产生。因此IVIG的免疫调节活性取决于相应的巨噬细胞的极化状态，IVIG能够触发M2到M1巨噬细胞的转变，这可能有助于癌症的治疗[2,3]。此外，IVIG还能影响人或鼠的巨噬细胞的分化、刺激特异性基因的激活、转绿翻译分泌应对外部刺激的细胞因子。
临床使用结果表明，IVIG可能具有抗肿瘤生长和转移的作用。通常能在癌症病人体内检测到抗自身的抗体(抗DNA、抗RNA、抗平滑肌肌肉细胞抗体等)，它们的出现伴随着淋巴瘤和乳腺癌的恶性转化，因此使用同一疗法治疗肿瘤和自身免疫疾病有合理的理论基础，近年来相关疗法明显增加。IVIG虽然不是癌症患者的一线治疗药物，但有研究认为IVIG在抗凝性治疗中是一种潜在有用的辅助治疗药物。George E. Moore提出使用多克隆免疫球蛋白治疗恶性肿瘤的可能性，他指出血清中存在抗肿瘤的天然自身抗体[4]。随后IVIG开始公开作为一种抗肿瘤使用的药物，但是通常是作为伴随治疗进行的，直接使用IVIG治疗肿瘤的报道十分稀少[5,8]。
通过一系列动物试验和人体内试验表明IVIG能明显减弱肿瘤的活性、抑制肿瘤细胞的转移。Shoenfeld 和Fishman使用高剂量(25 mg/小鼠)的IVIG注射小鼠，观察到肺部癌细胞减少70%，IVIG能明显抑制肺部黑色素瘤细胞的形成，同时明显降低了小鼠覆膜内癌细胞的转移[9]，Shoenfeld的团队还在兔子的角膜上植入CT26细胞，IVIG治疗10天后CT26细胞完全消失[11]。IVIG在小鼠体内的抗肿瘤效果是依赖Fcγ受体，不仅能降低体内新陈代谢，还能削弱小鼠模型体内癌细胞的生长，这种效应与肿瘤相关的髓细胞极化状态的变化有关。IVIG通过与活性Fcγ受体结合来扭曲与肿瘤相关的细胞的极化状态，从而抑制肿瘤生长。有研究发现，IVIG调节肿瘤转移与天然自身抗体的Fab片段更相关。相对动物实验的数据充分，IVIG治疗肿瘤的人体试验十分稀少。2001年，Fishman团队报道了第一例IVIG治疗黑色素瘤转移的案例[9]；2006年Castro和他的团队报道了一例IVIG治疗胸腺癌的案例[10]；2007年，Jacob Schachter 和Colleagues在9个病人中开展了二期临床试验。结果表明，高剂量使用IVIG能部分减轻肿瘤生长及转移[8]。
一系列的研究表明，IVIG可能通过以下途径对抗肿瘤[12] :
① 激活FcgR。通过IVIG中特殊的IgG亚型激活FcgIIA和FcgIIIA的受体，从而激活下游抗肿瘤机制。
② 影响细胞分化。IVIG能抑制体内一些恶性肿瘤细胞的分化，例如nb2-11c淋巴瘤细胞，hct-116和CT26结肠癌细胞和mca-105肉瘤细胞。IVIG能增强促凋亡因子的表达，例如肿瘤细胞上的p53、p21和Fas。
③ 影响新陈代谢。IVIG抑制缺血部位的VEGF介导的血管增生、血液灌流，下调VEGF在活化的内皮细胞上的表达水平。
④ 影响细胞因子和趋化因子的表达水平。IVIG显著提高单细胞分泌IL-12的水平，促进Th1促炎环境抑制肿瘤生长。增强周边环境中NK细胞的活性，调节IL-10的表达，下调CCL2的表达。
⑤ 影响金属蛋白酶的表达和粘附。IVIG抑制MMP-9基因水平和蛋白水平的表达。⑥ IVIG含有天然抗肿瘤抗体。IVIG中含有少量的天然自身抗体包括IgM, IgG and IgA 。其中包含了一种具有广泛的非特异性的IgG分子，可以中和特定于癌症的抗原。IVIG中还包含天然自身抗体能结合Arg-Gly-Asp (RGD)序列，从而阻止细胞对细胞外基质的附着，可能有助于抑制肿瘤转移。
IVIG能识别肿瘤细胞细胞质、核酸和细胞膜上的抗原，尤其是表皮抗原，例如抗VEGF抗体。近期研究表明，健康人群体内可能含有高含量的抗VEGFR1的天然自身抗体IgG分子，有研究通过筛选血浆中抗VEGFR1和抗VEGFR2的天然自身抗体治疗肝癌[13]。
2
天然自身抗体和抗肿瘤天然自身抗体血浆
天然自身抗体被发现于1960s，是指机体在接触到外源性抗原之前就已经存在的抗体，作为人体的第一道抵御感染的防线，为机体特异性免疫的建立赢得了时间[14]。天然自身抗体具有保护，协调或者其他生物活性功能，在机体内早已存在，遇到抗原之后可以不经过刺激形成记忆细胞马上表达形成。近年来的免疫学研究表明，天然自身抗体是人体内非常重要的抗病系统。它与特异性抗体不同，是介于固有免疫和适应性免疫之间的一种成分，在两个免疫系统之间起着桥梁作用。从人的出生到老年，天然自身抗体一直保护着机体免受疾病的袭击。然而在进入中老年阶段，天然自身抗体水平将随年龄而逐渐下降，导致多种疾病发病风险上升，如各种实体性肿瘤、心脑血管疾病及老年性痴呆等。在正常人体内，每天都有少量的癌细胞形成，天然自身抗体起着重要的免疫监视作用，摧毁不断形成的肿瘤细胞。如果人体内一直保持较高的天然抗癌抗体水平，就不会发生肿瘤疾病。
天然自身抗体主要由B-1细胞分泌(90%) (B-1细胞容易误解为记忆B-1细胞；腹腔B-1a的某些亚群类似于记忆B细胞，但本质上并不是记忆细胞)，分布成年老鼠/人类的各个部位，包括腹膜腔、胸膜腔、脾脏、骨髓、淋巴结。B-1a细胞主要产生于胎儿时期，因此认为胚胎时期的任何的抗原暴露都有可能极大地影响到天然自身抗体的产生[14]。天然自身抗体具有亲和力低、非特异性、化合价低、广泛交叉性等特点，其编码基因具有VDJ重排和种系样核苷酸结构。另有研究显示内源性自身抗原，外源性抗原和生殖系成分可以塑造不同分化形式的天然自身抗体。
早期人们认识天然自身抗体主要基于ABO血型的IgM抗体。 随着科学技术的发展，已发现天然自身抗体中还包括IgG和IgA。天然自身抗体中主要的成分是IgM，同时也含有大量亚型的非特异性的IgG分子，通过识别肿瘤细胞相关的寡糖和修饰过的细胞表面结构产生抗瘤功能。由于IgM 灵活的抗原结合结构，五聚体，非特异性结合范围广，天然自身抗体中对其的研究较多；IgG和IgA起先被认为在识别抗原中没有作用。最近发现IgG在系统先天免疫反应中发挥作用，可以通过纤胶凝蛋白与和甘露糖结合凝集素(MBL) 结合形成复合物[15,16]，利用人类单核细胞上面的 FcγR1 receptor，引起单核细胞的吞噬作用。纤胶凝蛋白作为天然IgG抗体免疫机制的桥梁，可以增强免疫。目前已经发现Anti-VEGFR天然IgG抗体，可以通过抑制血管内皮增长因子受体(VEGFR1)抑制癌细胞的生长，包括：肝癌、胰腺癌、鼻咽癌。
研究表明，约有5-8%的正常人血浆中富含天然抗癌抗体(为人群平均水平的5-10倍)，这一组人群因免疫监视功能极强，而终生患癌症的风险极小[14]。据此提出用正常人富含天然抗癌抗体血浆治疗实体肿瘤的理念。通过实验室细胞学研究证实, 血浆天然抗癌抗体可以明显抑制多种癌细胞的生长、诱导细胞凋亡，包括原发性肝癌、腺细胞肺癌、鼻咽癌、胃癌及胰腺癌等。由于IgG在体内含量较高，接近全部抗体的80%，且与抗肿瘤的ADCC 活性和经典补体通路激活关系密切，所以选择以IgG为主要检测对象。IgM也有很强的抗肿瘤作用，但其血中含量低(5%左右)，分子量太大，难以透过血管壁与实体肿瘤直接接触， 产生有效的抗瘤作用。 所以IgM在体内的抗癌作用可能非常有限。从制备抗癌丙球的角度出发，检测IgG是唯一的选择，因为99%的丙种球蛋白组分都是IgG。
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Oligoclonal
为了达到更好的疗效，多种靶点单一的单抗药物联用的策略并不少见，传统的抗体联用是批准同时使用两种或以上的药物治疗疾病。目前抗体联用治疗策略只批准了两种，一种是以HER2为靶点的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的联用治疗乳腺癌，一种是免疫调节抗体易普利姆玛和纳武单抗联用治疗黑色素瘤。
Oligoclonal是有别于传统抗体组合联用的一种新形式，是通过不同的比例和组合把不同的抗体混合为一个药物，Oligoclonal在肿瘤中的联用可以克服肿瘤的异质性和适应性。在研的抗体联用策略多是联合使用针对肿瘤的两个或以上的抗体药物，只有两个抗肿瘤的Oligoclonal在临床试验中：MM-151(混合了三个抗EGFR的IgG1抗体)，Sym004(混合了两个抗EGFR的IgG1抗体)。在研抗肿瘤Oligoclonal[17]如下表所示。
Oligoclonal的研发多集中在抗病毒、抗细菌感染邻域。抗细菌感染的Oligoclonal有两个在研药物，一个药物混合了以艰难梭菌外毒素A和B为靶点的两个抗体，一个药物是混合了抗金黄色葡萄球菌的α-毒素和F-元件白细胞毒素的Asn-1抗体LukSF /LukED /HlgB以及抗白细胞毒素的LukSB四种抗体。此外，Oligoclonal CT-P27混合了两种以不同禽流感亚型的血球凝集素为靶点的抗感染的抗体，这种组合方式可以广泛中和所有抗原亚型，治疗不同变异的疾病。在研抗感染Oligoclonal[17]如下表所示。
目前，大部分Oligoclonal是采用平行方法，单个抗体分别进行GMP标准表达纯化，然后按照处方的比例混合成一种药物。“单罐”生产法也是一种生产Oligoclonal混合物的方法，应用混合的表达相应抗体的细胞系混合物在同一个生物反应器中生产，细胞稳定表达抗体的轻链和重链是生产Oligoclonal的关键。此外，Symphogen还开发了一种新的稳定生产包含位点特异性Oligoclonal的方法。
Oligoclonal的临床前研究中需要充分考虑混合物以及其中各组分的药代动力学，应该确定生理学性能的一个相关的范围以维持活性稳定。在临床试验中，剂量的确定和给药间隔也应该考虑到混合物中每一个单独抗体的药代动力学，监测病人体内活性比例的变化状况。此外药理毒性的叠加和不明确作用机制的叠加也需要充分考虑，下图是Oligoclonal设计生产中需要注意的问题[17]。
(a)根据生物学或疾病背景研究设计治疗方案和选择目标分子。关键考虑做单特异性还是多特异性Oligoclonal。(b)进行临床前研究，定性分析混合物及其中包含的单个抗体的各种性能，不断优化治疗方案及目标分子。(c)配方比(混合物中抗体的比例)的选择可能是Oligoclonal发展最关键的决定点，并且与临床前试验、生产考虑和后期临床发展密切相关。(d)对于Oligoclonal有众多的生产策略，特别是平行的GMP指导但个抗体的生产和“单罐”生产法，这些都将影响配方比率和商业成本。(e)在临床前对药物动力学和安全性的评估。 (f)临床试验。研究应该同时考虑单个的抗体和混合物的情况。如对单个抗体清除率加快或影响其治疗效果，可能需要重新考虑配方的比率。(g)临床试验应充分考虑对体内外周环境的监测，以确保足够的数据以支持混合物的药效(例如，混合性的混合物与单个抗体的活性)。
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比较分析
血液衍生的多克隆抗体(IVIG)的使用面临着有限的可用性障碍，有感染血液传染疾病的风险。由于血浆的不同来源，不同批次的产品有所不同，最重要的是血浆中含有十分少量的针对性特异性抗体，其特异性很低。与天然自身抗体相比较，重组的Oligoclonal混合物中所含的抗体可以根据需求进行选择，具有很高的特异性、亲和性，中和抗原的能力高，并且避免了多抗体情况下抗原表位识别不灵敏，因此，Oligoclonal在药物效能上可能超过天然自身抗体。
Oligoclonal另一个优势是可以在临床前研究过程中更准确、更合理的定制各种抗体混合的比例，不需要经过生产和筛选大批量多克隆抗体表达变异的复杂过程。目前为止，没有证据表明多特异性抗体比单特异性抗体的组合更具有优势。有研究表明，抗体混合物比双特异性抗体具有更高的效能。IVIG、抗肿瘤天然自身抗体血浆和Oligoclonal相比较，各自特点如下：
1) IVIG和抗肿瘤天然自身抗体血浆有感染血液疾病的风险。均来源于人血浆，有感染血液疾病的风险。
2) IVIG和抗肿瘤天然自身抗体血浆中抗体的亲和力和特异性都较低，使用IVIG的不良反应比较多。
3) IVIG和抗肿瘤天然自身抗体血浆在生产中批次差异性大。IVIG和抗肿瘤天然自身抗体血浆中的抗体浓缩物来源于血浆，其各组分含量与所使用血浆有关。
4)抗肿瘤天然自身抗体血浆的治疗效果有待评价。目前临床试验信息太少。
5)从血浆中筛选出大量抗癌天然自身抗体十分困难，目前使用的靶点不是热门成熟型靶点。天然自身抗体来源于人血浆含量较低，同时富含天然抗癌抗体的人比例极低，因此从血浆中筛选出大量抗癌天然自身抗体十分困难。目前使用的靶点不是热门成熟型靶点，不确定是否对晚期肝癌患者和肿瘤转移患者有效。
6) Oligoclonal开发难度最大。在混合物组分构成，混合比例及体内各组分的相互影响等方面需要深入研究。
参考文献
[1] Murray PJ, Allen JE, Biswas SK et al. Macrophage activation and polarization: nomenclatur -e and experimental guidelines. Immunity 41(1), 14–20 (2014).
[2] Sica A, Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest.122(3), 787–795 (2012).
[3] Ries CH,Cannarile MA, Hoves S et al. Targeting tumorassociated macrophages with anti-CSF-1R antibody reveals a strategy for cancer therapy. Cancer Cell 25(6),846–859 (2014).
[4] Moore GE,Sandberg A, Amos DB. Experimental and clinical adventures with large doses of gamma and other globulins as anticancer agents. Surgery 41(6), 972–983 (1957).
[5] Besa EC. Use of intravenous immunoglobulin in chronic lymphocytic leukemia. Am. J. Med. 76(3A),209–218 (1984).
[6] Carmeli Y,Mevorach D, Kaminski N, Raz E. Regression of Kaposi’s sarcoma after intravenous immunoglobulin treatment for polymyositis. Cancer 73(11), 2859–2861 (1994).
[7] Merimsky O,Meller I, Inbar M, Bar-Yehuda S, Shoenfeld Y, Fishman P. A possible role for IVIg in the treatment of soft tissue sarcoma: a clinical case and an experimental model. Int. J. Oncol. 20(4), 839–843 (2002).
[8] Schachter J, KatzU, Mahrer A et al. Efficacy and safety of intravenous immunoglobulin inpatients with metastatic melanoma. Ann. NY Acad. Sci. 1110, 305–314 (2007).
[9] Shoenfeld Y, Levy Y, Fishman P. Shrinkage of melanoma metastases following high dose intravenous immunoglobulin treatment. Isr. Med. Assoc. J. 3(9), 698–699 (2001).
[10] Murie-FernandezM, Gurpide A, De La Cruz S, De Castro P. Total remission of thymus carcinoma after treatment with intravenous immunoglobulin. Clin. Transl. Oncol. 8(9),697–699 (2006).
[11] Damianovich M, Solomon AS, Blank M, Shoenfeld Y.Attenuation of colon carcinoma tumor spread by intravenous immunoglobulin. Ann.N. Y. Acad. Sci. 1110, 567–577 (2007).
[12] Angel L Corbí, et al. The potential of intravenous immunoglobulins for cancer therapy: a road that is worth taking[J].Immunotherapy. 2016 May;8(5):601-12.
[13] Wang Y, et al. Study of natural IgG antibodies against vascular endothelial growth factor receptor 1 in hepatocellular carcinoma[J].American journal of cancer research, 2017, 7(3): 603.
[14] Holodick N E et al. Defining Natural Antibodies[J].Frontiers in immunology, 2017, 8.
[15] Wu L, et al. Inhibitory Role of Natural IgG Antibodies against VEGFR1 in the Proliferation of Pancreatic Cancer[J]. JOP. Journal ofthe Pancreas, 2017, 18(2).
[16] Cai W, et al. Inhibitory effects of natural IgG antibodies against VEGFR1 and HER2 on the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells. Oncol Lett 2016 (in press)
[17] Davide Corti, Jeffrey D Kearns. Promises pitfalls for recombinant oligoclonal antibodies- based therapeutics in cancer and infectious disease. Immunology 2016, 40:51-61
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