PCR现在已经成为分子实验室的标配,无论是基因检测、基因定量、分子克隆、组装、突变、测序等等,都离不开PCR技术。在PCR过程中,引物设计是非常重要的一环,特别是qPCR的引物设计,决定了我们扩增效率是否达标和扩增产物是否特异。今天小编为大家举个例子,设计一对qPCR引物。
qPCR引物设计,通常要留意以下几点:
GC含量50%-60%
Tm值50℃-65℃
上下游引物尽量接近
引物末端最好是G或C
避开二级结构复杂区域
引物尽量在目的基因的3’ 端
引物尽量跨越内含子
目的基因是否有不同的剪切变体
……
这么多要注意的怎么办?!Primer-blast相信很多小伙伴们都用过,只要输入序列设置条件就可以设计得到理想的引物序列了。但是很多情况下,我们的要求往往不仅于此。下面,我们以人的EGFP(Epidermal growth factor receptor,表皮生长受体因子)基因为例,设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物!
1. 查询基因结构
之前小编已经为大家介绍了如何利用NCBI查询基因结构了(错过了可以戳这里), 首先查询Homo EGFP的基因结构:
2. 确定设计引物位置
可以看到,这个基因有多种不同的转录本,而前8个外显子区域是完全一致的(绿色小竖线)。我们的目的是将不同的转录本都扩增出来,那将反向引物设在第8个外显子之前就可以实现了。
3. 找到mRNA的序列号,进入GenBank
在该页面里继续往下拉,找到mRNA和蛋白质的GenBank序列号。点击mRNA的序列号,进入GenBank。借助Highlight Sequence Features,我们可以快速确定第8个外显子的位置。
4. 确定下游引物设计位置
点击Highlight Sequence Features后,浏览器的下方就会出现选项,选择查看Exon,找到第8个外显子,这样就能快速定位了。我们确定了第8个外显子到下游至1236bp为止。
确定下游位置后,点击Pick Primers,就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。
5. 设计引物
由上一步我们知道了第8个外显子的位置至第1263 bp结束,那我们设计引物时,反向引物的位置不超过1263 bp。另外,qPCR的产物大小一般不超过300 bp,并且退火温度设置在57℃-63℃的范围内,跨外显子的设计有助于辨别基因组DNA的污染……设置好这些参数后,我们就可以点击Get Primers呢。
这时,NCBI就会弹出来告诉你,这样的参数选择会扩增到其他剪切变体,我们勾选不同的剪切变体并提交,就可以获得合适的引物对了!这些引物对的退火温度,都在60℃左右。根据实验目的,选择特异性好和引物自身互补越少的引物进行实验,成功率还是相当高的呢!
6. 引物特异性验证
其实,Primer-Blast除了可以设计引物外,还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面,输入我们设计好的上下游引物,其它参数可以不调整,提交后,NCBI就会告诉我们这对引物的情况了!
相当方便有木有啊~科研小白,受到引物设计的“神圣洗礼”后,终将修炼成为PCR达人。
来源:GenStar
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