【技术分享】qPCR引物设计有妙招

来源：小桔灯网

qPCR现在已经成为大部分分子实验室的标配，无论是基因检测、基因定量、病原体检测、SNP分型等等实验，都涉及到qPCR技术。在整个qPCR技术中，引物设计是非常重要的一环，决定了扩增效率是否达标、扩增产物是否特异；最终决定我们的结果是否可用。

您是不是也在qPCR引物设计中不知所措：

如何使引物特异性最佳？

遇到多个转录本应该怎样设计引物？

有什么简单方法能一学就会？

在设计qPCR引物时，通常要留意以下几点：

GC含量50%-60%、Tm值50℃-65℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C、引物尽量在目的基因的3’ 端、引物尽量跨越内含子、目的基因是否有不同的剪切变体……

这么多要注意的怎么办？！今天小编带大家一起设计qPCR引物，让qPCR引物设计成为你的绝杀技能。

下面，我们以人的EGFR（Epidermal growth factor receptor，表皮生长受体因子）基因为例，设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物！

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查询基因结果 

首先，通过NCBI查询Homo EGFR的基因结构，这里要注意对比基因名称、种属，确保都要一致。

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确定引物位置 

我们的目的是将不同的转录本都扩增出来，所以需要找到这些转录本的同源序列。可以看到，这个基因有多个不同的转录本，第一个转录本的第8、9个外显子区域是所有转录本的同源序列（红框内的绿色小竖线）。只需要将引物设在第8、9个外显子之间就可以了。 

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找到mRNA的序列号 进入GenBank 

在该页面里继续往下拉，就能找到mRNA序列号，点击即可进入GenBank了。借助Highlight Sequence Features，我们可以快速确定外显子的位置。

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确定引物位置 

点击Highlight Sequence Features后，浏览器的下方就会出现选项，选择查看exon，这样就能快速定位外显子的位置啦。我们确定了第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp。

确定位置后，点击Pick Primers，就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。

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设计引物 

我们已经查到第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp，那在这个区间设计引物，才能保证把所有的转录本都扩增出来。另外需要注意，qPCR的产物大小一般不超过300 bp，并且退火温度设置在57℃-63℃的范围内最佳，跨内含子的设计有助于辨别基因组DNA的污染……设置好这些参数后，我们就可以点击Get Primers啦。

这时，NCBI就会弹出来告诉你，这样的参数选择会扩增到其他剪切变体，我们勾选不同的剪切变体并提交，就可以获得合适的引物对了！ 

这些引物对的退火温度，都在60℃左右。根据实验目的，选择长度适中、特异性好和引物自身互补较少的引物进行实验，成功率还是相当高的呢！

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引物特异性验证 

其实，Primer-Blast除了可以设计引物外，还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面，输入我们设计好的上下游引物，其它参数可以不调整，提交后就可以看到这对引物是否在其它基因上也存在啦，如果全部都显示在我们想要扩增的基因中，说明这对引物的特异性棒棒哒！

相当简单有木有啊～是不是感觉自己已经告别科研小白的身份，瞬间掌握了qPCR引物设计的绝招啦。