文章对164个肿瘤组织进行了全面的分子分析，发现食管鳞状细胞癌（ESCC）与食管腺癌（EAC）并不相似，进一步通过分子特征区分了ESCC和EAC，并将ESCC细分为三个亚型。研究还发现食管腺癌与一类胃腺癌非常相似。本研究为更合理的食管癌分类提供了框架，并为新疗法奠定基础。
文章题目：Integrated genomic characterization of oesophageal carcinoma
研究团队：The Cancer Genome Atlas Research Network
发表时间：12 JANUARY 2017
期刊名称：Nature
影响因子：40.137
研究背景
在西方，食管癌的5年生存率是12-20%，最近几十年，EAC发病率在西方国家增加了几倍，主要发生在胃交界处附近的食管，与肥胖、胃返流及巴雷特食管有关。EAC发病率与近端胃癌发病率越发接近。在西方，ESCC占上部和中部食管癌的多数，与吸烟、饮酒有一定关联。而在非西方国家，ESCC的风险因素还不那么确定。
目前EAC和胃食管交界处(GEJ)的腺癌的分类仍未明确，在组织学上的不同之处仍存在争议。为了完善食管癌的分类，研究者对在GEJ处的的164个食管肿瘤、359个胃腺癌和36个GEJ腺癌进行了全面的分子分析，评估对食管癌进行分类的方法，确定了分子特征和候选路径，并提供潜在的治疗靶点。
样品收集和分子特性描述
通过对GEJ、食管、胃或不确定来源的组织进行分类，确定了90个ESCC，72个EAC，36个不确定起源的GEJ癌，63个胃GEJ癌，140个胃底癌或胃体癌，143个胃窦癌或幽门癌。详情见下图。
图1 样本来源及分类
研究人员对164个食管癌进行了二代测序，包括全外显子测序，单核苷酸多态性(SNP)阵列分析（用于评估体细胞拷贝数变化(SCNAs)，DNA甲基化和mRNA和microRNA测序，低深度(6-8x)全基因组测序（51个样品），反相蛋白序列分析（113个样品）。
ESCC和EAC的分子分离（多组学聚类分析）
icluster聚类
接着，研究人员利用SCNA、DNA甲基化、mRNA和miRNA表达数据进行icluster综合聚类，发现鳞状癌和腺癌在聚类中是相互分离的。详情见下图：
图2 多组学聚类分析结果
食管癌的体细胞基因组变异分析
MutSigCV分析
研究者使用MutSig寻找ESCC和EAC中的显著突变基因。在ESCC中，发现了显著突变基因TP53、NFE2L2、MLL2、ZNF750、NOTCH1和TGFBR2。在EAC中，TP53、CDKN2A、ARID1A、SMAD4和ERBB2检测到显著的突变。这些发现与巴特雷食管中CDKN2A和TP53突变的显著性相一致。
图3 MutSigCV分析结果
SCNA分析：基因拷贝数变异分析软件-GISTIC
研究采用GISTIC软件分析SCNA数据来识别扩增和删除区域。
虽然EAC和ESCC存在相同的SCNA扩增和删除区域，但两者之间依然存在差异的SCNA。在EAC中发现VEGFA(6p21.1)，ERBB2(17p12)，GATA6(18q11)和CCNE1(19q12)基因的扩增，以及SMAD4(18q21)的缺失。ESCC发现SOX2(3q26.33)、TERT(5p153.33)、FGFR1(8p11.23)、MDM2(12q14)、nkx2(14q13)的扩增和RB1(13q14)的缺失。另外，在ESCC中发现了新的重要基因——Hippo途径阴性调节因子VGLL4的和自噬因子ATG7的缺失。
结合突变和SCNA的数据显示，细胞周期调控因子经常发生突变。 在ESCC中，CDKN2A的失活率和CCND1的扩增率分别占76%和57%，ESCC还存在CDK6扩增或RB1缺失的情况。 而在EAC中，细胞周期失调模式有所不同：CCND1只在15%的肿瘤中扩增，而CCNE1的扩增更为常见。在76%的EAC中，CDKN2A因突变、删除或表观遗传沉默而失活。这些数据揭示了细胞周期激酶抑制剂的潜在治疗作用，尤其是对ESCC。
EAC和ESCC都能检测到染色质修饰酶的突变。区别在于，在腺癌中，影响swi/snf编码基因ARID1A, SMARCA4和PBRM1的突变更为常见；而在ESCC中，组蛋白修饰因子KDM6A(UTX)、KMT2D(MLL2)和KMT2C(MLL3)变异更为频繁。因此，尽管EACs和ESCC的许多代谢通路存在相同的变异，但受影响的特定基因却不一样，这反映了不同的病理生理学，需要不同的治疗方法。这些数据告诫大家不要将EACs和ESCCs混为一体进行临床试验。（图3）
图4 EAC和ESCC的染色质修饰酶的突变
ESCC的分子亚型
使用icluster对ESCC数据进行综合聚类，得到了两个类icluster1和icluster2(图4)。在icluster2中，研究人员识别到一组具有共同特征的肿瘤，包括SMARCA4的突变(编码SWI/snf因子BRG1)，DNA甲基化增加(图4，最右边的样本)和相对不变的SCNA特征(图5)。我们将具有上述特征的肿瘤指定为第三类——ESCC3亚型。最后分出三种亚型:ESCC1(n=50)、ESCC2(n=36)和ESCC3(n=4)。
图5 icluster对ESCC数据进行综合聚类
图6 SCNA特征
ESCC1的特征是NRF2通路的变异，该通路调节氧化应激物(包括一些致癌物质和化疗药物)的适应能力。NFE2L2基因产生突变导致NRF2转录因子(KEAP1和CUL3)的降低，这与预后不良及放化疗耐药性相关。另外，ESCC1中发现高频的SOX2和TP63基因扩增(图3c)。ESCC1基因表达与TCGA数据的经典亚型的肺鳞癌和头颈鳞癌相似，具有相似的体细胞变异。
ESCC2的特征是NOTCH1或ZNF750的突变率更高， KDM6A和KDM2D高频失活突变，CDK6的扩增，以及PTEN和PIK3R1的失活。ESCC2中的白细胞浸润高以及裂解蛋白caspase-7表达较高，后者暗示着XIAP介导的细胞凋亡反应可能会得到增强。Fisher检验的结果显示，在ESCC1和ESCC2之间甲基化差异最大的基因是免疫调节分子BST2，在ESCC2(扩展的数据图7)中该基因的甲基化程度低，基因表达量高。
ESCC3中没有发现细胞周期的遗传调节基因，并且四个样本中只有一个的TP53突变。所有样本激活PI3K通道的基因都有变异，并且每个样本的SMARCA4，3/4样品的KMT2D/MLL2基因都带有变异。对TCGA HNSCC数据集比较分析发现，这些现象只在ESCC3的鳞状肿瘤出现。
ESCC的分型结果显示地理关联的可能性极大：越南患者(唯一的亚洲采样点)在ESCC1中最多，ESCC2亚型大多来自东欧和南美患者。4个ESCC3肿瘤均来自美国和加拿大的患者(P=0.001，fisher精确测试)。越南患者的肿瘤在NFE2L2突变富集；这种NFE2L2突变表明越南患者的患癌可能与一种常见的氧化应激物或遗传易感性有关，但并非所有的越南ESCC患者都会发生NEFE2L2变异。
与EAC相比，ESCC富集C>A替换，C >A替换与吸烟或烟草咀嚼有关，但ESCC的亚型之间并无显著区别。
之前有报道，人类乳头状瘤病毒(HPV)能引发宫颈癌和HNSCC，还可能引发ESCC。但是他们将ESCC mRNA序列数据与TCGA HNSCC数据进行比较后发现，ESCC的HPV转录水平与HPV-阴性的HNSCC肿瘤相似，这表明HPV病毒可能不是ESCC的诱因。
与胃癌相关的食管腺癌
EAC和ESCC、胃癌的关系界线一直都没有明确。研究发现ESCC与HESCC的基因表达模式更接近，而EAC与胃癌的基因表达模式类似。胃癌有四个分类:（ (1) Epstein-Barr virus (EBV) infection, (2) microsatellite instability (MSI), (3) chromosomal instability (CIN) and (4) genomic stability (GS))；EAC与胃癌CIN分类（染色体不稳定肿瘤）分子相似度最高。
研究者用EAC、CIN胃癌和ESCC的基因数据进行无监督学习算法聚类，发现EAC和CIN胃癌往往会聚类在一起，而ESCC单独成类。
通过分析CIN肿瘤和EAC的特征发现：相对于胃癌，EAC有更高频的SMARCA4突变和肿瘤抑制子RUNX1的缺失，但是APC突变率更低。基因拷贝数分析显示CIN胃癌的脆性位点基因FHIT和WWOX的缺失率较高，而VEGFA和MYC基因的扩增在EAC中更常见。但这些数据仍无法作为胃和食管的肿瘤绝对的二分类特征，无法明显区分肿瘤类型。
结论
以上分子数据表明，EAC和ESCC这两亚型在各种平台上都表现出不同的分析特征。相对于EAC，ESCC与其它的SCCs疾病较为相似，而EAC与胃癌有惊人的相似之处。因此，将EAC和ESCC结合在一起进行新辅助、辅助或系统性治疗的临床试验是不可取的。
参考文献：
[1] Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic characterization of oesophageal carcinoma[J].Nature, 2017, 541:169-175.
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