蛋白定量DIA产品,主要采用数据非依赖性采集模式(data independent acquisition,DIA),通过液质联用技术(LC-MS/MS)对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,结合传统的数据依赖性采集模式(datadependent acquisition,DDA)构建的谱图库,利用业内顶尖的商业化DIA分析软件Spectronaut,可对蛋白质组进行鉴定、定量,获得肽段、蛋白及所属物种来源、蛋白表达量变化等信息。
产品优势
蛋白定量DIA技术,采用全景式数据采集模式,效果对比下:
图1 HRM(DIA)vs Shotgun proteomics(DDA)
图中横坐标是分组的样本编号,纵坐标是蛋白质种类,该图展示的是各样本中,不同质谱采集模式下,蛋白质峰强度情况。其中DIA比DDA的峰强度覆盖度更好,偏向性较小;DDA缺失值较多,并且对高丰度肽段有偏向性。
产品应用
技术路线
信息分析内容
信息分析条款 | 信息分析内容 |
标准信息分析 | 1 谱图库构建 1.1 数据产出统计 1.2 谱图库鉴定结果 2 标准信息分析内容 2.1 数据产出统计 2.2 数据质控(组内变异系数、主成分分析以及样本定量相关性) 2.3 蛋白质鉴定和定量结果 2.4 蛋白质GO分析 2.5 蛋白质COG/KOG分析 2.6 蛋白质Pathway代谢通路分析 2.7 差异蛋白的GO富集分析 2.8 差异蛋白COG/KOG富集分析 2.9 差异蛋白的Pathway富集分析 2.10 重复性分析(仅针对设计了重复的实验) 2.11多样品间表达模式聚类(三个或三个以上样品可提供) 2.12 时间序列分析 2.13 差异表达蛋白互作分析 2.14 差异表达蛋白亚细胞定位 |
定制化信息分析 | 3 蛋白质组与转录组/RNA-seq表达量关联分析 3.1 表达量关联分析: 3.1.1 从鉴定、定量、差异三个层面进行关联统计 3.1.2 对定量层面关联结果细分为如下五类,并分别对其做GO/COG/Pathway注释分析: 蛋白和mRNA表达趋势相反; 蛋白无变化,mRNA差异表达; mRNA无变化,蛋白差异表达; 蛋白和mRNA均无变化。 3.1.3 蛋白组与转录组聚类分析 3.2 功能富集关联分析 3.2.1 GO富集关联分析 3.2.2 Pathway富集关联分析 3.3 转录组和蛋白组的Pathway整合图 |
Multi-laboratory assessment of reproducibility,qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature communications. 2017.
*注:SWATH技术与DIA技术原理相同,同为二级谱采集荷质比范围内全部母离子的碎片离子信息,但不同仪器公司开发此技术时使用的名称有别,故可以理解为同一种技术。
背景:实验结果可重复是科学研究最基础的原则。本文评估了全球11家实验室共同鉴定和定量到的蛋白数据集,其重现性、线性动态范围和灵敏度都非常接近于SRM——蛋白定量金标准。这份数据支持SWATH联合肽段标准打分的分析方法,适合于大范围实验室间全面、重现性好的蛋白组研究。
方法思路:
图1 实验设计
30个稳定同位素标记肽段(SIS)分成5组(group A-E),每组6种肽段,每组样本中肽段的稀释浓度从1fmol到10pmol(绿色标记S5),然后将每组肽段稀释4次后混入HEK293样本中(S1-4),获得一系列稀释浓度从0.012到10000fmol。将样本分成相同的11份分发给全球范围内的11个实验室,评估1天、1周内不同地点的数据采集情况。
主要结论:
1)蛋白鉴定情况
在全球11个实验室采集的229份SWATH-MS数据中,过滤条件为蛋白水平FDR 1%,共检测到4984种蛋白,4077种蛋白在超过80%的样本中被检测到。
图2 蛋白鉴定的数目和一致性
每种颜色代表一个实验室的所有数据,11个实验室所有数据集的重复性中位数是91.6%(蛋白水平)和79.5%(肽段水平)
2)定量重现性
经过肽段水平的中位数均一化后,利用4077种在超过80%样本中检测到的蛋白去计算同一天内、不同天内、不同实验室数据采集之间的变异系数,分别是8.3 ± 16.2%, 11.9 ±17.2%, and 22.0 ± 17.4%。
图3 变异系数
比较单个实验室一天内、不同天内的CV变化,以及不同实验室间的CV变化
3)线性和动态范围
利用样本中加入的同位素标准肽段,在每个实验室计算梯度浓度设置的标准肽定量结果线性拟合系数,平均决定系数(R2)是0.97。去除高浓度肽段信号饱和的点,决定系数增加到0.99。在样本之间设置的标准肽理论倍数有9和27,实际检测到的差异倍数是7.49和19.6,主要原因也是高浓度的标准肽已经导致质谱仪信号检测饱和。
图4 平均峰面积和蛋白水平动态范围统计
平均峰面积图各点连接显示出各实验室间良好的线性指标(图左),蛋白水平动态范围是4.5个数量级范围(图右)
展望:
Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of MouseDorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular& Cellular Proteomics. 2016.
背景:慢性疼痛是一种治疗方案有限的复杂疾病。虽对其发病机理进行了多次研究,但各结果间存在较大不一致性,主要受限于传统蛋白质组shotgun技术固有的缺陷。发病机制依然不清晰。
实验设计:
图 5 实验设计类型
CFA慢性炎症性疼痛模型、Veh为其对照;SNI慢性神经性疼痛模型、Sham为其对照
主要发现:
1)DDA建库鉴定到3067个蛋白,迄今鉴定数最多的背根神经节蛋白研究。
2)DIA四组都鉴定到的蛋白有2526个,其中CFA和Vehicle都鉴定到的有2581个;SNI和Sham都鉴定到的2600个,表明实验重复性较好。
3)炎症性和神经性疼痛差异蛋白分别为64和77,两种模式共有差异蛋白为12个。
4)其中Serca蛋白在两种模式小鼠中表达量变化相反,表明两种疼痛的调控机制不同。
5)western blot和免疫组化对上述DIA结果进行了验证。图6 四组实验模型的蛋白聚类分析
1、蛋白鉴定和定量概况
表1 各样本鉴定结果概览
Name | Peptide number | Protein number |
N_1 | 73592 | 7123 |
N_2 | 83437 | 7720 |
…… | …… | …… |
表2差异蛋白统计列表
Comparsion group | Down-regulated | Non-regulated | Up-regulated |
T-VS-N | 381 | 8005 | 703 |
XR-VS-N | 242 | 8369 | 479 |
XR-VS-T | 137 | 9020 | 118 |
图1差异蛋白统计图
以Fold change≥2和Q-Value<0.05两个条件作为显著性差异蛋白的筛选标准,得到组间上下调蛋白统计(左图)及火山图(右图)
2、质控
图2CV分布及主成分分析
根据组内变异系数(CV,左图)评估实验的稳定性和重复性;通过主成分分析(PCA,右图),将同一实验组不同样本间聚合成簇。
3、功能分析
图3多样本关联分析结果展示
左图,样本相关性分析热图;右图,时间序列分析
图4显著富集的pathway统计图
图中x轴富集因子为注释到该Pathway的差异蛋白数除以注释到该Pathway的所有鉴定到的蛋白
表1 组织类样品送样要求
样品类型 | 送样量 | 备注 |
新鲜动物组织干重 | ≥50mg | 富含杂质或蛋白质含量低的样品量干重≥5g,如植物的根、木质部、韧皮部组织等 |
植物和蕈类真菌(如蘑菇、木耳)类 样品量湿重 | ≥1g | |
酵母、霉菌类真菌和细菌、噬菌体等微生物 | 200mg | |
新鲜培养细胞数(个) | ≥3~5×106(细胞沉淀体积 约30ul~50µl左右) | |
血液类 | 血清、血浆≥500µl;全血 ≥5ml | 解冻后血细胞会破裂,蛋白溶出来会影响分析,因此一般不建议送全血 |
表2 蛋白类样品送样要求
样本类型 | 送样量 |
蛋白液 | ≥200μg,浓度≥1µg/µl |
Q1:怎样选择标记定量或非标记定量?
标记定量一般用于比较背景相似的样本间的蛋白组差异,若同组比较的样本数≤8,推荐选择iTRAQ标记技术;若同组比较的样本数>8且≤10,推荐选择IBT标记技术。非标记定量技术的限制情况相对较少,无论样本间背景是否相似,若同组比较样本数>10,都可推荐选择非标记蛋白定量DIA;若希望蛋白鉴定数越多越好,或需要鉴定单个样本中的特有蛋白,样本数<10,也可推荐使用DIA。
综上,以下情况可优先选择iTRAQ:
1、定量样本数低于8个(即同时比较的样本数≤8)
2、样本背景极为相似(相同物种和相同的样本类型)
3、经费有限,需要通过高性价比方案完成研究
4、实现更好的重复样本间的定量重复性
更适合选择蛋白DIA定量分析的情况:
1、实验样本数高于10组
2、不同物种、不同来源或部位的样本,需要同时进行蛋白组分析和定量
4、追求更精准的定性定量效果,避免标记和液相分组引入的实验误差
5、需要对采集的数据进行多次分析
介于9-10个样本的项目,推荐华大IBT 10-plex定量产品。
Q2:蛋白定量DIA和传统的非标记定量有何优势?
传统的非标记定量一般需要通过分级的方法开展,耗时久、重复性差、数据结果可信度不高;蛋白定量DIA技术是新一代非标记定量技术,可通过更优的数据采集模式,在相同时间采集到更丰富的信息,压缩周期的同时,大福度提高样本间平行比较的重复性,数据结果可信度极高。
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