一文搞定P2A,T2A

转自：一文搞定P2A,T2A (baidu.com)在生物医学研究中，有时需要使用单个质粒在细胞或生物体中同时表达多个基因，为此，已经采用了几种策略:多个启动子融合到基因的开放阅读框架(ORFs);基因间剪接信号的插入；由单一启动子驱动表达的基因融合；基因间蛋白裂解位点的插入；基因间内核糖体进入位点(IRESs)的插入。这里重点介绍下IRES,因为IRES的使用很广泛，原因主要有以下几点：基因在IRES前后的共同表达； IRES后添加亚细胞定位序列的可行性； 含有IRES的商业表达质粒的可用性。然而，IRES有两个主要的局限性，首先就是因为IRES 通常都会大于500bp ，这可能会让构建病毒的质粒变大，降低了病毒的滴度；其次就是位于IRES后的基因的翻译效率远低于位于IRES前的基因。因此自剪切多肽2A就应运而生，能够克服以上两个弊端。自剪切多肽2A的命名及作用机制：自剪切多肽2A是源于口蹄疫病毒，2A多肽的平均长度为18-22个氨基酸。"2A"这个名称是指小核糖核酸病毒多蛋白的一个特定区域，是由研究人员采用的系统命名法产生的。如下图：

最近的报道表明，核糖体跳过了2A肽C端甘氨酸-脯氨酸肽键的合成，导致2A肽与其直接下游肽之间的分裂，结果如下。当然更深入的机制就是2A肽剪切反应发生在核糖体肽基转移酶中心，且翻译终止释放因子Erf1、erf3密切参与此过程。

有4种2A Peptide目前研究的比较多，我们也对这4个效率做个总结。这是4中2A Peptide，包括P2A,T2A,E2A,F2A,前面的GSG 是为了提高切割效率加的序列。

作者先是构建了几个质粒，将各个2A Peptide构建到GFP 和mCherry 两种荧光蛋白中间，后期可以用免疫荧光来进行观察。

先是在HEK293细胞中研究切割效率，从B 图可以直观的看到P2A 的切割效率最高，计算的方式就是 切割效率=切割的/(切割的+未切割的) ，我们来看A图，actin 为内参，C 是对照。接着看下α-GFP ，切割的条带越明显说明切割效率越好，当然前提是表达的质粒量是一样的。B 图就是对A 图的定量分析。C图的免疫荧光也是同样的道理，因为发生了切割，绿色与红色就是两个不同的蛋白，不会发生重合，绿色越亮，效率越好。这些都说明了P2A 的切割效率最好。当然作者也做了鼠的，斑马鱼的比较，结果都是P2A 的切割效率最好。现在你们明白该选什么构建比较好了吗？