该研究团队从3名结直肠癌患者的肿瘤组织以及周围健康组织进行取样，并从中分离出单细胞，用单细胞培育器官，从而实现在单细胞水平上研究癌症突变，通过对比来源于同一组织的正常细胞、癌变细胞的差异，解析癌症的发生发展过程。研究结果显示结直肠癌细胞具有广泛的突变多样性，其突变率远高于正常肠细胞，并且肠癌组织中每一个细胞遗传信息都不同，这表明肿瘤细胞的突变过程和正常细胞具有显著的差异性。
文章题目：Intra-tumour diversification in colorectal cancer atthe single-cell level
研究人员：英国Wellcome Sanger研究所、荷兰Hubrecht研究所
发表时间：2018.04.11
期刊名称：Nature
影响因子：40.137研究背景
最近的一些研究通过识别癌克隆亚群组织中的共有突变探究了癌细胞群中的遗传多样性。实际上肿瘤内遗传多样性可以通过单一癌细胞DNA测序进行全面的揭示，但是目前的单细胞基因组测序仍要依赖全基因组扩增，这会导致基因组覆盖不全和假突变的产生。表观基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学以及耐药性等功能状态的多样性有可能在肿瘤细胞群扩增的过程中发生。但是从同一个单细胞中收集所有这些特征和准确的基因组信息目前仍未被报道过。表观基因组学和转录组学多样性起源尚不清楚，并且这些过程是短暂性还是稳定性的也还不确定。
研究者开发了一种用新生结肠干细胞进行克隆器官的方案，比较了来自癌组织和新生结肠上皮细胞的单细胞。通过比较单个癌细胞基因组突变数量和同一组织单个正常细胞的突变数量揭示了肿瘤体细胞突变率和突变过程是否不同于正常细胞。
研究方法与研究成果
1.克隆器官衍生
将来自三个未经治疗的结直肠癌患者的组织每个切成4-6块，器官培养物来自于每块的细胞悬浮液，不同切块之间要保持隔离一周的时间。随后打通各个切片器官培养之间的联通以获得独立克隆癌类器官的单细胞，对于每个切片个体都要取正常的结肠癌样本以作后期对比。对克隆器官应用已知的360个癌基因的编码区域进行测序，以寻求可能的驱动突变，并对其中一个子集进行全基因组测序。此外还对克隆类器官在470,000个CpG位点出的甲基化状态进行了分析，RNA-seq用来评估对多种抗癌疗法应答机制。
2.体细胞突变系统进化树
研究者根据克隆类器官的体细胞突变为每个样本进行了系统进化树的推导(Fig.1a-c)。进化树显示来源于相同肿瘤组织的分支更为密切，然而每个类器官仍表现出广泛的遗传多样性，比如从P3.T3肿瘤样本分离出的类器官克隆中，至少有40%的突变和来自于该组织的其它克隆类器官不同。研究者在P1的癌细胞进化树中识别出了BRAF(V600E),PIK3CA(E81K)和ACVR2A(截短蛋白的indel)中可能的驱动突变，该样本的所有癌症克隆具有DNA错配修复缺陷和MLH1启动子甲基化的微卫星不稳定性特征。此外PTEN和RNF43中的截短突变可能仅存在于子集；P2样本中存在截短的APC突变和一种纯合剪接位点TP53突变；P3样本中，癌症干细胞中存在KRAS突变和两个截短的APC突变，并且在部分分支中存在TP53框内缺失。在来自于三名患者的正常结肠上皮的克隆类器官中没有检测到驱动突变和MLH1甲基化。
3.正常细胞和癌细胞的突变负荷
在样本P1、P2和P3的正常类克隆器官中发现平均有3,792、3,172和3，621个碱基替换(Fig.2)，对应癌组织克隆中的平均碱基替换个数分别为72,398、22,292和14,209。在小indel和基因重排的数量上，正常类器官和癌克隆也存在很大的差异，正常结肠上皮细胞中样本P1、P2、和P3中indel的数量分别为227、130和167，癌克隆中indel的平均数量为27,893、1,485和2,021。有一种在正常结肠上皮细胞的克隆类器官中重排在P1、P2和P3样本中的癌克隆类器官中的重排负荷分别为71、176和67个。由于正常和癌克隆是从每个样本个体中相同时间获取的，所以体细胞的碱基替换、indel和基因组重排很可能发生在受精卵分化为癌细胞的过程中。癌细胞中额外的突变负荷大多数分布在进化树的分支中，因此它们是在癌细胞扩增之后产生的。
图2 正常和结直肠癌中的突变负荷
4.突变特征
研究者提取出突变特征并估算了每个特征对进化树的贡献，从而发现了8个碱基置换突变特征。这些特征包含了先前描述的1,5,6,17,18,20和26，还有一个未被报道的特征。每一个突变特征都是一种突变的结果，包括DNA损伤或修饰、DNA修复和复制，每个环节都可能影响特征的突变结果。特征1突变数量和有丝分裂数量相关；签名5起源不确定，突变数量会随着时间积累增加，并且在不同组织中有不同的比率。特征1和5在大多数人类癌症中都有存在，但是在正常细胞中特征1占主导地位，特征5主要出现在大肠干细胞突变中(Fig.1)。三个样本癌组织的树干中都出现了特征17和18，这两个特征在许多癌症类型中都由被发现，并且特征18可能与活性氧组织诱导的DNA损伤或者碱基缺陷修复有关。
突变特征在三种癌症进化树中的贡献模式是不同的，在P1中主要是特征6,20,26和indels，P2中是特征5,17,8和indels，P3中主要发生的是特征5,18和indels在NTA和NTT三核苷酸上的T>G,T>A,和T>G的突变。在结构变化层面上，P1癌克隆携带缺失、倒位和串联重复，很少发生易位，拷贝数变化也相对平坦(Fig.1)；P2中携带了伴随着拷贝数变化的各种类型的重排；P3中携带了大量的重排并导致拷贝数状态的异常。
若干特征的突变数量在不同分支的差异表明它们在不同癌症部位的突变过程不同。研究者根据特征1的突变数量推算其在P1中的有丝分裂次数是正常细胞的1.9(0.5)倍，P2的癌细胞是2.5(0.2)倍，P3中的癌细胞是1.7(0.2)倍。特征1突变率增加的另一种解释是癌细胞中DNA甲基化的增加。但是与正常细胞相比，癌克隆类器官通常是低甲基化的。在进化树的远端分支中每次有丝分裂的碱基置换突变率相比于正常细胞都是显著增加的，因此研究者推断随着时间的推移，indel和基因组重排突变率的增加也预示着每个有丝分裂的突变率增加。
5.甲基化组和转录组
表观遗传学改变可能有助于肿瘤内细胞群体的多样性，因此研究者检测了正常和肿瘤衍生克隆类器官中470,000个CpG位点的甲基化状态。主成分分析显示来自于P1,P2,P3的正常干细胞聚集到一起(Fig.3)。除了两个P3的TP53野生型克隆，来自于每个结直肠癌的克隆类器官聚集在一起，但是与其他癌症和正常类器官的克隆分开。因此来自不同个体的正常结直肠干细胞的甲基化相对相似，来自不同个体的肿瘤表现出不同的表观遗传性状。P1符合称之为CIMP的全局超甲基化模式。
图3 肿瘤细胞群扩散过程中甲基化和转录组状态的多样化
为了研究转录组水平肿瘤内的多样性，研究者对正常和肿瘤类组织进行了RNA-seq。通过基因表达谱进行聚类分析以及甲基化的相关性分析，研究者发现所有的正常类细胞聚集在了一起(Fig.3b)，所有癌细胞都有单独的聚类。为每个样本构建基于甲基化和基因表达的系统进化树发现，基于甲基化和表达的树与基于突变的树具有相似的结构(Fig.3c)。每种癌症内的甲基化和转录组状态的多样性具有可遗传性、稳定性和肿瘤微环境独立性。
6.药物反应的多样性
将癌克隆类器官在体外进行结肠癌药物治疗，包括化疗剂5-氟尿嘧啶(5-FU)，多柔比星和7-乙基-10羟基喜树碱(SN-38，活性代谢物是伊立替康)和靶向药物阿法替尼(EGFR抑制剂)，nutlin-3a(TP53稳定剂)，MEK1/2抑制剂和AKT抑制剂。来自相同个体的不同组织具有高达1000倍的IC50值的显著差异(Fig.4)，其中一些差异归因于特定的体细胞突变。Nutlin-3在P3中在正常组织中的生长抑制作用要比癌组织更强，然而其他药物反应的其余变化机理并不明确。
图4 不同克隆组织对结肠癌常用临床药物的不同反应
讨论
先前的研究通过分析转录组、DNA拷贝数和单个细胞的功能来诠释肿瘤内的多样性，本文研究者率先对人类癌症的多个单细胞进行克隆，然后对其在遗传、表观遗传、转录组和功能水平上进行了整合分析和全面描述。在三种癌组织中的突变负荷都要比正常组织中要高，这些可能是由于从受精卵到结直肠癌分化过程的突变率增加造成的。经过多方研究比较发现体细胞突变率的增加在人类癌症发生过程中比较常见，这些突变率的增加是正常细胞中无活性或者低活性的突变过程，并且在癌细胞进化后期阶段发挥主要作用，但是这些过程的突变机制尚不清楚。DNA错配修复增加突变率的机制也是未知的，可能是由于体细胞遗传或者表观遗传改变造成的。伴随着肿瘤内突变、甲基化状态、转录组状态的多样性，产生了对治疗的生物学反应。
虽然一些甲基化和转录组变化在体外可能会丧失，但是研究者仍然可以根据系统进化树捕捉到甲基化和转录组的变化，这些变化似乎很稳定，并且在一定程度上与肿瘤微环境无关，因为它们在肿瘤被切除后也会持续存在。甲基化和转录组状态以及药物反应的多样性可能源于癌基因的突变，但是目前尚未可知。
未来的研究需要分析癌基因原代细胞的基因组、甲基化组和转录组以揭示癌细胞在体内发生的所有遗传、表观遗传和转录变异。尽管如此，该研究揭示了类器官系统在保留这些特征方面的优势，并且能够对单个细胞的克隆进行功能检测。分析表明，三种结直肠癌都有大量抗药细胞，这些抗性主要在肿瘤后期出现。
文章总结
肿瘤组织起源于一个细胞，在肿瘤细胞无限扩增的过程中，细胞会获得不同于其它细胞的遗传和表型信息，本文研究者发现与正常细胞相比，结直肠癌细胞的突变率明显增加，而且肿瘤组织中的每一个细胞都是独一无二的。肿瘤细胞的突变进程与健康细胞有着显著差异，在癌症确诊之前的很多年，突变率就已经发生改变。研究人员认为，这一时间能够为未来的诊断提供线索，有望成为检测到细胞早期突变率上升的关键期。
小编评论
该研究向我们展示了癌症发生的细节，通过比较个体健康细胞、肿瘤细胞的突变模式，可以了解到突变的状态，从而寻找到引发突变的原因。此外，了解突变的起源，有助于我们避免可能的风险因素，降低癌症的发生率。
参考文献：
[1] Sophie F.Roerink, Nobuo Sasaki, et al. Intra-tumour diversification in colorectal cancer at the single-cell level[J]. Nature, 2018,556: 457-462.
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