Nature与Cell神仙打架！分子和表型一样，机制却各执一词

Nature打脸Cell！lncRNA NORAD到底跟哪个蛋白结合并发挥功能？

近日长非编码RNA界发生了一起“神仙打架”的事件。一个名为NORAD的长非编码RNA分别上了Nature和Cell，意外的是，在这两项研究中，NORAD都参与了基因组稳定性的维护，但是作用机制却完全不同！！！

那么，究竟是一个什么样的长非编码RNA可以幸运的得到两大顶级期刊的青睐？这场争议的焦点是什么？孰是孰非，我们如何判断？

带着这些问题，小又为大家解读这场争论：

1.NORAD是谁？

2016年，约翰霍普金斯医学院的Joshua T. Mendell等人在Cell发表研究“Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins”。

文章通过分析在阿霉素诱导的DNA损伤中，以P53依赖的方式上调表达的长非编码RNA表达谱，发现了LINC00657。当DNA损伤发生时，LINC00657的表达量上升，因此命名为NORAD（noncoding RNA activated by DNA damage）。

与其他长非编码RNA不同的是，LINC00657在物种间非常保守，并且表达量很高，与Actin相当。

NORAD在DNA损伤中发挥了什么功能呢？研究者惊奇的发现，在敲除NORAD后，HCT116细胞的染色体发生倍增或缺失。如下图：正常HCT116有45条染色体，敲除NORAD后，染色体数量变成79~88条，或者43~44条（这属于基因组稳定性研究中的逆天表型）。

由此可见，NORAD在维护基因组稳定性上发挥了重要作用。要解释NORAD的具体作用机制，就离不开RNA pulldown技术（该技术的具体详情，请查阅解螺旋公号旧文《想做lncRNA与蛋白互作？RNA pulldown技术了解一下》）。而不同的RNA pulldown技术的运用，也正是我们提到的这两篇文章的分歧之一。

2.NORAD的结合蛋白是PUMILIO？ 还是RBMX？

RNA pulldown技术可以鉴定与长非编码RNA结合的蛋白，根据对RNA处理方式的不同，可以分为in vitro RNA pulldown和in vivo RNA pulldown。

In vitro RNA pulldown是在体外合成相应的长非编码RNA或者长非编码RNA的片段，并与细胞裂解液孵育一定时间，由此捕获与长非编码RNA结合蛋白的方法。

而in vivo RNA pulldown是通过紫外照射等方法将细胞内的RNA与蛋白交联在一起，在利用体外合成的与该长非编码RNA序列互补的探针将长非编码RNA与结合的蛋白一起捕获的方法。

Joshua T. Mendell等人在Cell发表的研究中，使用的是In vitro RNA pulldown的方法。由于NORAD具有5个非常保守的重复序列，研究者认为这些保守序列很重要，命名为NORAD damain(ND)。

研究者根据这些保守的序列设计了探针，用这些探针和细胞裂解液孵育，从而捕获蛋白。通过质谱的方法，研究者鉴定到了非常多与NORAD domain结合的蛋白，但只有PUMILIO蛋白能同时被5个NORAD domain的探针结合，因此被选为接下来研究的重点。

然而，PUMILIO是一个RNA结合蛋白，却从未被报导与DNA损伤相关，那么，NORAD又是如何通过影响PUMILIO参与DNA损伤的呢？

利用PAR-CLIP seq技术，研究者发现PUMILIO能结合一批参与DNA损伤的基因的mRNA，并且过表达PUMILIO确实能造成这些基因的降低，与敲除NORAD的现象一致。

所以，研究者最后给出的模式图是NORAD通过吸附作用，抑制PUMILIO的活性，使PUMILIO的活性保持在正常范围。当NORAD缺失时，PUMILIO被释放，活性大大增加，造成有丝分裂的异常。

这篇Cell的文章解读完了，小又想说：表型逆天，结果丰富，解释合理，没毛病！ 

然而！！！2018年9月，哈佛和耶鲁大学的Mathias Munschauer和eric S.Lander 等人在Nature发表一篇题为 “The NORAD lncRNA assembles a topoisomerase complex critical for genome stability”的研究。

该研究认为NORAD通过结合RBMX，而不是PUMILIO蛋白，参与DNA损伤和有丝分裂。

eric S. Lander等人首先讨论了in vitro RNA pulldown的假阳性，而后采用in vivo RNA pulldown技术，结合质谱分析，鉴定到一批与NORAD结合的蛋白，PUMILIO也在其中，但是却排到了185位!!!

通过进一步的筛选，研究者将注意力集中在RBMX上，因为：1. RBMX在NORAD结合的蛋白中排名靠前；2. 也是很重要的原因：敲低RBMX的表型与NORAD敲除的表型类似。

研究者猜测NORAD能帮助RBMX与其他蛋白形成复合体，在NORAD野生型和敲除的细胞中做RBMX的IP，鉴定到一批只在NORAD存在的情况下，才与RBMX结合的蛋白，其中包括TOP1和PRPF19等。

由此，研究者得到的模式图是：NORAD通过与RBMX结合，帮助RBMX与TOP1和PRPF19形成新的复合体。该复合体在DNA复制，基因组稳定性和同源重组方面发挥了重要作用。NORAD的缺失会导致复合体的解聚，失去功能。

这样看下来，也是没毛病啊！！！科学研究不是一场公说公有理，婆说婆有理的争论，实践是检验真理的唯一标准！NORAD到底结合PUMILIO还是RBMX，还要用更严谨的实验设计和更有力的实验数据说话。

3.孰是孰非?这回站Nature!

回看两篇文章，我们发现分歧点主要有以下两点：

1.Cell的研究发现NORAD主要存在于细胞质中，因此在筛选蛋白时，首先排除了细胞核内的蛋白，选择了在细胞质中发挥作用的PUMILIO。

而Nature的研究发现NORAD存在于细胞核中，因此选择了定位于细胞核的RBMX。

2. Cell的研究认为NORAD具有的5个重复序列很重要，并以此制定了结合蛋白的筛选标准。

而Nature的研究却发现NORAD的5’端就可以结合RBMX，5个重复序列并不与RBMX结合。

下面我们来逐点解析：

1.这其实是RNA的定位问题。

在长非编码RNA研究中，RNA的定位往往与其功能息息相关。从两篇文章得到的FISH结果，我们发现在正常情况下，NORAD其实是在细胞核与细胞质中均有分布的，细胞质中的分布略多。

Cell的图：

小又站队Nature，是因为Nature的研究不仅做了正常情况下NORAD的分布，还做了在DNA损伤中，即药物Doxorubicin和Camptothecin处理后，NORAD的分布。

我们可以看到，发生DNA损伤后，NORAD显著的在细胞核中富集。这说明NORAD主要在细胞核中参与DNA的损伤修复。

2.这其实是如何证明RNA的某一段序列是否有功能的问题。

在Cell的研究，研究者默认NORAD的5个保守的重复序列是NORAD发挥功能的区域，但是，全文并没有验证过这5个NORAD domain的结构！！！

而Nature的研究中，在发现NORAD只通过5’端的序列，不依赖所谓的NORAD domain结合RBMX后，研究者果断做了删除5’端序列，只保留NORAD domain的过表达，发现它并不能拯救NORAD缺失的表型，这说明NORAD的5’端对功能很重要，而不是NORAD domain。

至此，我们可以看出，虽然RNA pulldown技术是研究长非编码RNA与蛋白互作的常用技术，但是该技术会鉴定到许多与长非编码RNA结合的蛋白，因此，如何通过严谨的实验设计，找到真正与RNA结合并发挥功能的蛋白，才是研究的重点和难点！