p53是一种广为人知的人类抗癌蛋白，其被誉为人类基因组的守护者，野生型的p53（WTp53）广泛存在于自然界中，近日，来自加利福尼亚大学的科学家们通过研究发现，在特定情况下WTp53会促进肿瘤发生，而不是抑制肿瘤发生，相关研究结果刊登于国际杂志Cancer Cell上，这一研究发现解释了一种既定的悖论，尽管p53在50%以上的人类癌症中都处于突变状态，但在特定的人类癌症中却不经常发生突变，比如肝癌。研究人员在研究中发现，WTp53能通过增强癌症代谢来刺激肿瘤生长，其中的关键是PUMA（p53正向凋亡调控因子）的蛋白质，能在线粒体中发挥作用；在合适水平下，PUMA能干扰线粒体的正常功能，并促进氧化磷酸化过程转换至糖酵解过程。p53的确会通过降低产生基因组毒素的氧化磷酸化过程来抑制肿瘤发生，然而一旦肿瘤形成的话，p53或许就会增强肿瘤的进展。文章中，研究人员对细胞样本、小鼠模型和人类患者进行研究后发现，p53实际上具有相同的功能，但却会在两种不同的条件下扮演着两个完全相反的角色。
1、WTp53是HCC细胞的肿瘤发生所必需的
研究人员为检测WTp53在人类癌细胞中的作用，构建四环素诱导型p53 shRNA抑制WTp53在人类癌细胞中的表达。敲减WTp53的4种HCC细胞系的增殖明显抑制，但对携带WTp53的其他人癌细胞系没有明显影响（图1A）。
为理解WTp53 KD对各种人癌细胞系增殖的不同影响的基础，研究者分析了WTp53 KD对糖酵解的影响。敲减WTp53降低了四种HCC细胞系中的糖酵解，但没有降低其他人癌症细胞系，说明增殖受抑制是由于p53耗尽后这些HCC细胞中糖酵解受抑制的结果（图1B和1C）。使用不同的p53 shRNA获得了一致的数据，排除了脱靶效应的可能性。
为进一步了解WTp53促进这些HCC细胞中的糖酵解，研究者分析了这些细胞中丙酮酸驱动的氧化磷酸化（OXPHOS）活性。数据表明p53 KD显着增加丙酮酸驱动的HCC细胞ATP产生但不影响其他人癌细胞系，表明WTp53抑制这些HCC细胞中的线粒体OXPHOS（图1D）。WTp53可以被小分子p53激活剂RITA激活。用RITA（0.3mM）处理HepG2细胞可增加p53靶基因如PUMA和CDKN1A的表达，并以p53依赖性方式促进糖酵解（图1E-1G）。该剂量的RITA不诱导HCC细胞的凋亡。RITA对SK-Hep1细胞中WTp53的激活也诱导了PUMA和CDKN1A的表达以及糖酵解。因此，在HCC中适度激活WTp53促进癌症代谢转换而不诱导显着的细胞凋亡。这些数据支持了WTp53是HCC细胞的肿瘤发生和糖酵解代谢所必需的概念。人癌细胞如HeLa和HCT116细胞主要从糖酵解中获得它们的能量，并且它们的OXPHOS活性基本上通过不依赖于WTp53的机制被消除（图1B，1C）。这些发现表明WTp53需要维持人类癌细胞中的癌症代谢转换，而线粒体OXPHOS活性相对较高。
图1. WTp53是维持某些人类癌细胞生长和糖酵解所必需的
2、PUMA在HCC细胞中介导WTp53依赖性抑制OXPHOS
为了理解WTp53如何抑制线粒体OXPHOS的机制，研究者关注了PUMA，是p53的转录靶标并编码p53依赖性细胞凋亡所需的线粒体蛋白。此外，实验和临床数据表明PUMA是致癌的。 PUMA敲减的HepG2细胞在体外和体内极大地抑制其生长，支持了PUMA介导的WTp53在促进HCC细胞肿瘤发生中起作用的观点（图2A和2B）。此外，类似于WTp53 KD对HepG2细胞的OXPHOS的影响， HepG2细胞中的PUMA KD抑制糖酵解ATP和乳酸的产生（图2C-2E）。 PUMA敲减，而非p21敲减，则增加了丙酮酸驱动的OXPHOS和丙酮酸线粒体摄取（图2F和2G）。PUMA的沉默似乎比对WTp53的沉默具有更强的对OxPHOS的影响，表明WTp53仅是人癌细胞中PUMA的诱导物之一。为了证实p53-PUMA轴的这种代谢作用的生理相关性，研究者们检查了这些作用。小鼠肝脏p53和PUMA线粒体丙酮酸代谢的研究使用具有组成型活性p53和Puma /小鼠的TT53TSD（Thr18Ser20突变为Asp）敲入小鼠模型，显示小鼠肝脏中p53的活化增加了PUMA和Cdkn1a的表达（图2H）。此外，WTp53以PUMA依赖性方式抑制小鼠肝细胞中的线粒体丙酮酸摄取和丙酮酸驱动的线粒体ATP产生（图2I）。因此，p53-PUMA途径在抑制线粒体丙酮酸摄取和OXPHOS中发挥进化保守和生理作用。
图2. PUMA介导HCC细胞中WTp53依赖性癌症代谢转换
3、PUMA通过破坏MPC的功能抑制线粒体丙酮酸的摄取
线粒体丙酮酸载体（MPC），是一种由MPC1和MPC2蛋白组成的线粒体膜复合物，对于将丙酮酸转运到线粒体中是重要的。为了阐明PUMA如何抑制线粒体丙酮酸摄取的机制，研究假设PUMA，可能通过蛋白质 - 蛋白质相互作用抑制MPC的功能。使用免疫共沉淀法证明了过表达的PUMA同种型a和b与MPC相互作用（图3A）。在具有CO-IP的HepG2细胞中证实了内源MPC和PUMA之间的相互作用（图3B）。为了进一步验证活细胞中MPC和PUMA之间的相互作用，研究者在活细胞中表达了eGFP标记的MPC2和mCherry标记的PUMA或PUMA的各种缺失突变体中的荧光共振能量转移（FRET）测定。数据显示全长PUMA和两个PUMA缺失突变体（del92和delBH3）与活细胞中的MPC2相互作用，但PUMA缺失突变体（del137）未能与MPC2相互作用，表明氨基酸之间的PUMA结构域（aa）92和137需要与MPC2相互作用（图3C）。MPC1和MPC2的寡聚化是MPC将丙酮酸转运到线粒体中的功能所必需的，研究者研究了PUMA对MPC1和MPC2的寡聚化的影响。 HepG2细胞中的PUMA KO增加了MPC1和MPC2的异源寡聚化以及MPC2的同源寡聚化（图3D）。为了支持这一结论，使用FRET测定法，研究者们证明了PUMA抑制MPC2的同源寡聚化和活293细胞中MPC1和MPC2的异源寡聚化（图3E）。因此，PUMA通过破坏MPC复合物的寡聚化和功能来抑制线粒体丙酮酸的摄取。
图3. PUMA与MPC相互作用并抑制MPC1和MPC2的寡聚化
4、PUMA与MPC的相互作用需要IKKb介导的PUMA磷酸化
为进一步了解调节PUMA和MPC之间相互作用的机制，研究者关注了PUC的中心域（aa 92-137），这是MPC和PUMA之间相互作用所必需的。PUMA有三个潜在的磷酸化位点Ser10、Ser96、Ser106，其中两个位于PUMA与MPC相互作用所需的区域内。使用磷酸化位点预测软件GPS（高阈值截止值为3.538），研究者们预测S96和S106可能是IkB激酶b（IKKb）的磷酸化。为了支持这一观点，研究者发现用特异性抑制剂抑制IKKb激酶活性可以预防肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激后PUMA的Ser / Thr磷酸化（图4A）。此外，与TNF-a刺激后的WT PUMA相比，IKKb介导的PUMA的磷酸化位点突变体（S96 / 106A）的磷酸化（表示为MT PUMA）显着降低（图4B）。为了阐明这些作用在PUMA-MPC相互作用中，研究者们检测了IKKb表达增加的IKKb表达对MPC1和MPC2寡聚化的影响。 IKKb的表达增加促进了PUMA和MPC之间的相互作用，并且降低了MPC1和MPC2的寡聚化，表明IKKb在S96 / 106处的PUMA磷酸化促进了PUMA和MPC之间的相互作用（图4C）。IKKb途径是致癌的并驱动癌症代谢转换从OXPHOS转变为人类癌细胞中的糖酵解。为了测试PUMA MPC途径参与IKKb的代谢作用，研究者们检测了PUMA在IKKb驱动的线粒体丙酮酸摄取中的重要性，并发现IKKb的过表达以PUMA依赖性方式抑制线粒体丙酮酸摄取（图4D）。这些数据支持这样的假设，即IKKb对Ser96 / 106的PUMA磷酸化促进了PUMA和MPC之间的相互作用，从而抑制了线粒体丙酮酸的摄取。为了进一步检验这一假设，研究者们比较了WT PUMA和MT PUMA过量表达的影响。与WT PUMA相反，MT PUMA可以与MPC复合物充分地相互作用（图4E），也不破坏MPC1 / 2的寡聚化（图4F）。此外，在PUMAKO HepG2细胞中存储WT PUMA而不是MT PUMA的表达可以抑制MPC依赖性线粒体丙酮酸摄取（图4G）。因此，PUMA代表了一种新的功能性链接，以赋予WTp53和IKKb的致癌作用在促进癌症代谢转换中的协同作用。
图4. 在S96 / 106中，IKKb介导的PUMA磷酸化对于PUMA-MPC相互作用是必要的
5、HCC中高水平的PUMA与减少线粒体丙酮酸摄取和增加糖酵解呈正相关
为了研究PUMA依赖性代谢功能在HCC肿瘤发生中的临床相关性，研究者检查了来自患者的新切除的HCC样品中PUMA、乳酸和丙酮酸的水平。与PUMA促进从OXPHOS到糖酵解的代谢转换的结论一致，高水平的PUMA与HCC样品中较高水平的乳酸和细胞质丙酮酸水平适度相关（图5A-5C）。为了确定HMA中PUMA水平和线粒体丙酮酸摄取的相关性，从HCC分离线粒体并检查线粒体丙酮酸摄取。研究者们用MPC抑制剂UK5099处理线粒体，并根据线粒体丙酮酸摄取水平将样品分成两组（图5D）。 HCC中的PUMA和乳酸水平与线粒体丙酮酸摄取水平呈负相关（图5E和5F）。总之，这些数据表明通过抑制线粒体丙酮酸摄取和OXPHOS，在HCC中PUMA依赖性代谢作用的临床相关性。
图5. PUMA水平与癌症患者HCC糖酵解代谢呈正相关
6、HCC中高水平的PUMA与HCC患者的预后不良相关
由于PUMA促进了有利于肿瘤发生的癌症代谢转换，假设HCC中的PUMA水平可以预测HCC患者的临床结果。为了验证这一假设，研究者分析了HCC病例中PUMA的mRNA水平。与匹配的邻近正常组织相比，HCC中的PUMA的mRNA水平显著增高（图6A-6D）。基于HCC中PUMA的mRNA水平，将3年或更少的无复发存活（RFS）的HCC患者群组分成两组：HCC中高PUMA表达的患者（前25％）和其余患者。在HCC中，高PUMA表达的患者比较低PUMA表达的患者RFS更短（p = 0.0116），但是CDKN1A的mRNA水平与HCC患者的RFS无关（p = 0.4528）（图6E和6F），从分析中除去具有突变体TP53的HCC患者时（图6G）。为了进一步确定PUMA表达水平在与HCC患者RFS相关的一些常见临床病理参数中的预后价值，进行了单变量和多变量分析。单变量分析显示PUMA表达水平与肿瘤数量，微血管侵犯（MVI）等三种病理学标志物显着相关。和portalvein肿瘤血栓形成（PVTT）（表1）。多变量Cox比例风险模型表明，在调整肿瘤数量，MVI和PVTT后，PUMA的表达水平是HCC患者RFS的独立预后标志物。总之，HCC中高水平的PUMA表达与HCC患者的不良预后相关。
图6. HCC中高水平的PUMA表达与癌症患者的不良预后呈正相关
本文研究结果给癌症药物的开发提供了警示，在癌症患者中增强p53功能的药物疗法或许会不经意地引发相反的效应。WTp53所扮演的角色或许能够解决p53生物学中几个长期存在的问题，同时其还能帮助研究人员开发新型的癌症疗法，尤其是在p53突变的癌症中通过激活WTp53或回复其功能来有效消除人类癌症。
参考文献
Kim J, Yu L, Chen W, Xu Y, Wu M, Todorova D, Tang Q, FengB, Jiang L, He J, Chen G, Fu X, Xu Y. Wild-Type p53 Promotes Cancer MetabolicSwitch by Inducing PUMA-Dependent Suppression of Oxidative Phosphorylation.Cancer Cell, 2019,35(2):191-203.
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