毕业季就像在打怪，一个不小心，就会犯错。就像最近需要提供可以打论文制作费的银行卡，我明明在备忘录中备注了，还设置了提醒，但是还是忘记了。今天研究生处老师找我才想起来。刚哥说是因为我已经很久没怎么进食碳水化合物，所以神经紊乱，记忆减退，最主要是会忘事、变笨。有文献报道称长期生酮饮食会造成神经系统的紊乱，出现失眠、记忆减退、精神衰弱等神经精神症状。瞬间觉得这个猜测有一定的道理，今天早上就开心的吃了一根玉米。结果可能是碳水戒断现象，吃了可能2个小时不到，就困得不行，特别想睡觉。哎，到底是吃还是不吃呢。后来想通了，既然是类似戒断现象，那就慢慢加量，明天早上吃1/3根。
先给大家分享一点我这周的小小体会和收获吧。我有个师妹，人小小个，但能量还挺大的。在我未正式和她有接触之前，她属于那种懵懵懂懂的小女生，也不是特别清楚自己在做什么，但有个很大的优点，很心细，另外执行能力也还行。在我们成为了伙伴，一起工作的这大半年中，我们一起扩了病毒，一起养了细胞，一起拍了照，一起认识了很多新的东西。她的改变非常大，实验越做越好，知道去问为什么，知道查询相关文献。我也越来越放心她单独做实验。
最近，我发现她有个特别牛逼的技能，就是可以用把肺组织切片切得非常漂亮，有层次感，可以切到肺上皮细胞的纵切面，可以切到气管的纵切面和横切面，而且切得好的概率越来越大，什么都不多说，看下图1，2（这还不是最好的，因为我没有那部分数据）。我问过她，有没有什么诀窍，她也是糊里糊涂的。不过从现在开始，她已经是个实验有心人，开始注意在每一次石蜡切片的标本脱水、固定、切片的每一个步骤，做好了记录。希望在不久的将来她可以写个帖子跟大家分享石蜡切片的手法。其实我跟很多人都讲过我做实验的经验教训，她是比较能听进去的那一类。她现在都可以和我一起讨论课题了，我甚是欣慰。
我记得我得硕士老板在我最开始做实验的时候，跟我说过，在我们起步比较晚的时候，最开始都是不段模仿、重复，最后才能赶上，然后才有创新，才有超越。而最难的就是早期的模仿、重复。那是一个需要建立知识体系的时间段，只有把那个难关闯过，你后面才知道把你学到的东西放到知识体系相应位置，然后才会有一定的规律可循，才能看到食物的内在联系，才能创新。她是一个坚韧、有大智慧的人。这一番话，受益至今。今天分享给大家，希望在那段重复、模仿，看不到任何希望的日子里，常常激励自己，彼方尚有荣光在。
特此感谢果子老师一次。相互作用的蛋白做了聚类分析后，有我之前预判的，也有新发现的。科学研究就是那么有意义，那么的迷人，你永远不知道结局是什么。你只有不停的做，才会有不同的发现，课题也才会有一次次的修订，最后得出一个相对正确的结论。
今天就跟大家絮叨到这了。
这周主要分享的就是CCK8的实验步骤、实验分组、及检测方法。
上周我们已经知道CCK8是什么，以及它的用途。这周先来看看CCK8的实验步骤。
实验步骤:
从上周的帖子中，我们知道细胞数目、细胞状态对CCK8的值影响很大。另外，虽然说10%的CCK8溶液对细胞培养影响不大，但是一个异物在培养基中待太久，也会影响细胞状态。
做过显色实验，比如测定蛋白浓度或者ELISA的人，细心一点都会发现，这个显色反应有一定的饱和度（不是指终止反应后），也就是它的化学反应随着时间变化是呈一个“S”型的。那就意味着，如果反应时间延长，原本有差别的两组数据就会变得没差别。所以时间也很关键。在sigma的很多测ATP、NADPH、糖原的这些盒子，最后都是算的速度或者酶反应学中的K值。
下面开始讲实验步骤，其实每个公司的实验步骤都大同小异，我在分享步骤的同时，也会分享一点小窍门。
1.先用细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数量（此处也多说一句，细胞最好不要超过10^8/mL,细胞一定要吹打均匀，呈单细胞，呈单细胞，呈单细胞），然后准备接种细胞；
2.倍比稀释一个细胞浓度梯度，在96孔板中，我常规稀释的浓度如下：1000, 2000,5000,10000,15000,20000,25000,50000个/孔，共8个浓度。每组 4-6 个复孔，每孔100 μL 培养基（此处培养基不需要加抗生素）；
3.接种后根据细胞的类型不同，悬浮细胞通常培养4小时。贴壁细胞根据细胞种类不同，培养 2-4 小时，主要使细胞贴壁又没开始进入分裂期（注意使用排枪将）。
4.然后每 100 μL 培养基加 10 μL CCK-8溶液。要是实验技术不成熟，害怕没有完全把液体加进去的，我用过的两种解决办法，一种是加完后，使用水平离心机，500G，1min，短暂离心；另外一种是将CCK8放入培养基中制成10%的液体，对细胞进行换液。后一种方法有一些些弊端，下周仔细分析。
5.一般的试剂盒说明书会告诉你，试剂培养一定时间后测定 OD 值。那这个一定的时间是多少呢，这个需要你自己在做标曲时就应该清楚。我通常会在加入CCK8液体后观察液体颜色的变化，在1小时开始测定OD值，湖面基本每隔1小时测一次，总共测6-8次。
6.关于测定波长，一般的试剂盒推荐使用450nm吸光度。我喜欢用双波长进行测定，检测波长450nm，参比波长600nm。不知道检测波长和参比波长的可以参考此篇帖子，连接如下：https://wenku.baidu.com/view/e835d91d77232f60ddcca1ac.html
7.最后制作出一组以时间为为横坐标，OD值为纵坐标的多条曲线及一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。
1.Hela 229按0，1000, 2000,5000,10000,15000,20000,25000,50000个/孔铺板。细胞的贴壁时间从铺板后1小时开始（康宁的96孔板，每个牌子的孔板细胞贴壁时间是不一样的，对了血清也会影响细胞贴壁，所以一定要做预实验），4小时基本可以完全贴壁，6小时就开始有细胞在增殖，进入分裂期。所以在我的这个体系下，做标曲选择时间为铺板后4小时，细胞培养基为100μL。
2.细胞贴壁完全后，使用量程为2-20μL 的排枪加入10μL CCK-8溶液，轻轻混匀。
3.Beckman水平离心机短暂离心，500G，1min。
4.取出放入孵箱，每隔一个小时测定2次读数，检测波长450nm，参比波长600nm。一共读取6次读数。
5.用其他孔细胞数值减去细胞数为0孔，得到一组数据。
6.制作以时间为为横坐标，OD值为纵坐标的多条曲线，如下图3
1.细胞的增殖速度，多少小时繁殖一代。（这里又涉及到，不同的铺板浓度，不同代数的细胞增殖速度不一样）
2.实验所需时间，你加了药物或者做了什么处理后，多少小时测定。
这些都需要成竹在胸。
1.在 96 孔板中接种单细胞悬液 (100 μL/孔) ，放在孵箱中培养
12-24 小时。
2.在每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) 。
3.短暂离心（可选择不做）。
4.将培养板置于培养箱内孵育 1-6 小时；
5.用酶标仪测定在 450 nm 处及600 nm处的吸光度。
1.在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，放在孵箱中培养
12-24 小时。
2.在每一空中加入不同浓度的待测药物。
3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（预实验结果或者根据文献报道）。
4.在每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) 。
5.短暂离心（可选择不做）。
6.将培养板置于培养箱内孵育 1-6 小时；
7.用酶标仪测定在 450 nm 处及600 nm处的吸光度。
我们都知道CCK8反应原理是一个氧化还原反应，那如果你的药物是氧化还原反应相关的药物，加入CCK8反应之前，更换新鲜培养基（此处有坑，如果操作不当会影响结果）。当待测药物影响较小时可以直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。
好了，今天就分享到这里，送大家一张美图（手机拍摄），希望大家心胸开阔，天天都有好心情。我们下周四见。
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