越来越多的证据表明，肿瘤新生抗原在产生自发抗肿瘤免疫反应和预测免疫治疗的临床反应中具有重要作用。尽管患者中存在大量新生抗原，但由于未能获得足够和持久的抗肿瘤免疫反应，因而不能完全消除肿瘤。鉴定针对肿瘤新抗原特异性免疫反应的信号通路可以为免疫治疗提供新的有效靶点。今年2月，中科院北京基因组研究所韩大力为第一作者，清华大学徐萌（Meng Michelle Xu）、美国芝加哥大学何川作为共同通讯作者在Nature上发表了题为Anti-tumour immunity controlled through mRNA m6Amethylation and YTHDF1 in dendritic cells的研究论文，揭示了RNA m6A修饰通过调控树突状细胞的溶酶体组织蛋白酶翻译效率，影响肿瘤抗原特异性的T细胞免疫应答新机制。
m6A修饰是mRNA上目前已知最丰富的修饰，负责mRNA的翻译后调控。m6A的调控功能主要由结合蛋白发挥作用。其中，YTHDF1能通过识别mRNA上的修饰并影响靶标基因的翻译。m6A相关分子的失调影响致癌基因的表达，从而将肿瘤发生发展与m6A关联。在这篇论文中，作者发现m6A阅读蛋白YTHDF1通过识别带有m6A修饰的RNA来调控新生抗原免疫相关蛋白。与野生型小鼠相比，Ythdf1-/-缺陷小鼠显示抗原特异性CD8+ T细胞抗肿瘤应答上升。经典树突状细胞中YTHDF1的缺失增强了肿瘤抗原的交叉表达和体内CD8+ T细胞的交叉呈递。从机制上讲，编码溶酶体蛋白酶的转录物被m6A标记并被YTHDF1蛋白识别。YTHDF1增加了树突状细胞中溶酶体组织蛋白酶的翻译，抑制组织蛋白酶显著增强了野生型树突状细胞的交叉表达。此外，在ythdf1−/−小鼠中，PD-L1的治疗效果显著增强，表明YTHDF1是肿瘤免疫治疗的一个潜在治疗靶点。
m6A甲基化从上游到下游的基本机制及m6A甲基化酶的主要类型如下：
（自：Yang Y, Hsu PJ, Chen YS,Yang YG. Dynamic transcriptomic m(6)A decoration: writers, erasers, readers andfunctions in RNA metabolism. Cell Res. 2018 Jun;28(6):616-624）
1.CD8+ T细胞在Ythdf1-/-小鼠中，是肿瘤控制的一个十分关键的必要条件
作者首先对野生型（WT）和Ythdf1敲除（Ythdf1-/-）小鼠分别皮下接种黑色素瘤细胞，发现Ythdf1-/-小鼠的肿瘤生长被显著抑制。相比于野生型小鼠，Ythdf1-/-小鼠的肿瘤组织中含有更多的免疫浸润CD8+ T细胞和自然杀伤性细胞（natural killer cells, NKcells）。由于CD8+ T细胞和NK细胞都是控制肿瘤生长的关键。因此，作者进一步分析了两种细胞对Ythdf1-/-小鼠抗肿瘤能力的贡献程度。研究发现WT小鼠和Ythdf1-/-小鼠的NK细胞表现出类似的脱粒反应， NK细胞的缺失对Ythdf1-/-小鼠的肿瘤生长没有影响。相反，在没有CD8+T细胞的情况下，ythdf1-/-小鼠的抗肿瘤反应被完全消除。表明CD8+ T细胞是Ythdf1-/-小鼠抗肿瘤的必要条件（Fig.1）。
2.Ythdf1-/-小鼠中树突状细胞的抗原提呈能力显著增强
为进一步确定小鼠体内是否会产生针对肿瘤新抗原的特异性CD8+T细胞应答，作者分析了野生型和Ythdf1-/-小鼠中表达针对SIINFEKLMHC-I复合物的肿瘤浸润的CD8+ T细胞所占比例（即对肿瘤抗原特异识别的CD8+T细胞）。结果发现尽管野生型小鼠没有在肿瘤内积累抗原特异性CD8+T细胞，但是在Ythdf1-/-小鼠体内对肿瘤新抗原的CD8+T细胞表现出显著增加的趋势。为了研究新抗原特异性CD8+T细胞在Ythdf1-/-小鼠体内的浸润是否是由于早期自发的CD8+T细胞启动增强所致，作者使用OVA介导的SIINFEKL多肽或肿瘤细胞在体外刺激了DLNs淋巴结中的淋巴细胞。同时通过ELISPOT检测干扰素-γ（IFNγ）量高低，来测定内源性CD8+T细胞反应。
用抗原刺激引流淋巴结中淋巴细胞并检测CD8+ T细胞的应答，发现Ythdf1-/-小鼠的T细胞能产生更多的γ干扰素细胞，表明宿主细胞中YTHDF1的敲除在早期阶段即可增强T细胞的活化。然而进一步研究发现，T细胞本身Ythdf1的敲除只能引起小鼠抗肿瘤能力的微弱提升。又因为树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）是主要的抗原提呈细胞。因此研究者提出假设，在Ythdf1敲除小鼠中，可能是由于DCs抗原提呈能力的增强而导致T细胞更好的活化，进而提高了T细胞的肿瘤识别能力。为了验证这一假说，作者将Ythdf1敲除的DCs和野生型DCs与肿瘤细胞共培养，再分别将纯化的DCs与T细胞共培养来检测其抗原提呈能力，发现Ythdf1-/- DCs可以更好地交叉提呈肿瘤抗原给T细胞。而后在Mettle14缺陷的DCs中也得到了一致的结论。综上可以确认，m6A与YTHDF1是DCs中限制抗原提呈的关键因素。检测DCs的抗原提呈复合物，进一步确认了Ythdf1-/- DCs中表观修饰对其抗原提呈的调控作用。此外，在小鼠中DCs中特异性敲除Ythdf1，也能够引起强烈的抗肿瘤免疫应答（Fig. 2）。
3.RIP-seq+m6A-seq+Ribo-seq联合分析揭示溶酶体组织蛋白酶是YTHDF1主要靶基因并影响T细胞交叉呈递能力
为确定m6A和Ythdf1在DCs中主要的调控功能，通过对野生型和Ythdf1-/-的DCs进行建库与测序，分析DCs中的YTHDF1的结合位点，m6A修饰位点和核糖体结合图谱。通过计算分析，发现YTHDF1敲除后大多数基因翻译效率显著下降，特别是被YTHDF1结合且带有m6A修饰的基因。且与预期一致，Ythdf1的缺陷并不会对m6A的分布产生严重的影响。通过KEGG富集分析，表明被YTHDF1结合且翻译下调的基因主要富集在吞噬小体和溶酶体相关的通路上。根据已有报道证实，限制DCs中溶酶体的蛋白质水解能减少DCs内抗原的破坏。由于组织蛋白酶负责DCs溶酶体中抗原的降解，而这些酶不仅大多数含有m6A修饰且被YTHDF1结合，同时在Ythdf1-/-DCs中也被明显抑制。综上可得，溶酶体组织蛋白酶大多受YTHDF1调控，从而影响DCs的交叉提呈能力，因此编码溶酶体组织蛋白酶的RNA是YTHDF1的主要靶点，并随后影响树突状细胞的交叉呈递能力。（Fig.3）。
Ythdf1-/-经典树突状细胞中，m6A修饰的转录本翻译效率降低，组织蛋白酶的蛋白水平下降，延缓了新生抗原的降解，从而促进内体或溶酶体中抗原的持续释放，最终有助于提升Uthdf1-/-树突状细胞中抗原呈递。接下来作者将WT小鼠和Ythdf1-/-小鼠中的GMDCs与B16-OVA细胞系进行共培养，发现Ythdf1-/-的GMDCs中OVA残留比Ythdf1+/+的GMDCs更多。使用蛋白酶抑制剂E64、CA-074和CasIII处理后，显著提升了WT树突状细胞交叉呈递效率。此外在WT小鼠中，组织蛋白酶被抑制后显著改善了体内抗肿瘤反应，表明组织蛋白酶是决定该小鼠模型中抗肿瘤反应的关键因素（ExtendedData Fig. 8）。
因此，树突状细胞中YTHDF1的缺失限制了溶酶体蛋白酶的表达，从而减弱抗原降解，最终改善CD8+ T细胞的交叉呈递能力。
4.YTHDF1调控蛋白水解酶来促进肿瘤生长
作者研究了新生抗原特异性CD8+T细胞在YTHDF1缺失后，能否增强对免疫检查点阻断（T细胞抑制剂受体PD-1）的抗肿瘤反应。由于IFNγ在Ythdf1-/-小鼠在CD8+T细胞中显著增加，并且IFNγ信号上调了PD-1的配体PD-L1的表达。与WT小鼠相比，Yhdf1-/-荷瘤小鼠的肿瘤细胞中PD-L1表达增加，而对IFNγ进行中和后则降低了PD-L1的表达。
接下来为了测试PD-L1阻断能否增强Uthdf1-/-小鼠抗肿瘤反应，作者对Uthdf1-/-荷瘤小鼠和WT荷瘤小鼠中分别同时使用抗PD-L1抗体（anti-PD-L1antibody）进行治疗。尽管40%的Ythdf1-/-小鼠肿瘤组织未经治疗就发生了消退，但经抗PD-L1抗体治疗后，Ythdf1-/-小鼠的肿瘤组织几乎显示出完全消退。而WT小鼠在经过抗PD-L1抗体治疗后也仅表现出肿瘤组织的部分消退。换句话说，通过将YTHDF1敲除，与针对PD-L1的检查点抑制剂结合，在小鼠模型中得到了几乎完全的肿瘤控制，不是40%的反应，而是接近100%的患黑色素瘤的小鼠对PD-L1抑制剂有反应。而这一机制——YTHDF1表达与CD8+T细胞数的负相关性，在结直肠癌的病患中也得到了证实。因此，免疫检查点阻断和YTHDF1基因缺失可能是改善部分患者免疫检查点阻断不良预后的一种新的治疗策略（Fig.4）。
目前已知的研究表明，肿瘤即便有新抗原表达，也能逃逸免疫识别。本研究结果揭示了在DCs中，被m6A修饰的溶酶体蛋白酶mRNA能被YTHDF1识别。而YTHDF1的结合促进了溶酶体蛋白酶的翻译，从而抑制了其对抗原的交叉提呈能力。这一新的机制使得YTHDF1可能成为免疫疗法的治疗靶点，可与新出现的检查点抑制剂或DCs疫苗相结合，促进临床肿瘤的治疗效果。总的来说，这个研究从mRNA表观修饰的这角度，给免疫检查点抑制剂疗效的提升，带来了新的机会。由于YTHDF1基因敲除在小鼠身上耐受较好，甚至没有观察到任何可测量的毒性。研究人员希望在未来的一年内，在人身上检测这个新型疗法。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-0916-x
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