免疫治疗
2018年被很多人称为中国免疫治疗的元年，在这一年，中国迎来了肺癌领域的首个免疫治疗药物，开启了肿瘤治疗的新纪元。随着各类免疫检查点抑制剂的上市，紧随其后的2019迎来了免疫治疗的2.0时代，免疫治疗逐渐成为癌症治疗领域必不可少的中坚力量。肿瘤免疫疗法被称为继手术治疗、药物治疗、放疗之后的第四种肿瘤疗法。
免疫治疗与常规的手术、放化疗和靶向治疗的不同之处在于该疗法旨在激活人体免疫系统而非直接针对肿瘤,通过激发机体的免疫系统,增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力, 达到控制和杀伤肿瘤细胞的目的。
我们通常所说的免疫治疗技术主要有以下三种：
1 | PD-1/PD-L1等免疫检查点抑制剂。 |
2 | CAR-T技术，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。 |
3 | 个体化肿瘤疫苗。 |
我们今天所要介绍的TNB就与免疫治疗息息相关。由于免疫系统具有区分自我和非我的超强能力，因此我们可以利用免疫系统的这种固有特性使其识别靶向肿瘤细胞上的非己抗原来控制癌症。
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TNB的概念
TNB（Tumor Neoantigen Burden），即肿瘤新生抗原负荷，是反应肿瘤细胞中总的新生抗原数量的一个指标，通常以每百万碱基中(Mb)的肿瘤基因组区域中包含的肿瘤新生抗原的数量来表示。
TNB可能在癌症免疫治疗中形成一种生物标志物，并为开发新的治疗方法提供动力，从而选择性地增强T细胞对这类抗原的反应活性。
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新生抗原的概念
什么是抗原？抗原是指能够刺激免疫系统产生抗体或效应细胞，并且能够和相应的抗体或效应细胞发生特异性结合反应的物质。抗原可以是任何诱发免疫反应的物质。肿瘤细胞在不断增殖的过程中会产生很多基因突变，其中部分基因突变会形成正常细胞所没有的蛋白或多肽，使得这些蛋白能够被免疫系统识别并攻击，称之为抗原。
什么是新生？形成新生抗原的基因突变是肿瘤细胞所特有的，正常细胞和组织中没有，即为新生。
新生抗原（Neoantigen），即由肿瘤细胞基因突变产生的，只在肿瘤细胞中表达，可以被免疫细胞所识别的，能够激活免疫系统的异常抗原。由于新生抗原能被宿主的免疫系统识别为非己，因此成为特异性、安全性的免疫疗法的靶标。
肿瘤新生抗原这一概念于2014年一炮而红。Rosenberg团队将其应用于治疗一名晚期胆管癌患者，该团队利用体外扩增的能特异性识别肿瘤细胞基因突变所致异常蛋白的T淋巴细胞，将其进行富集后二次回输给患者，成功治愈该癌症晚期患者。接下来该团队的后续研究证明了绝大部分肿瘤患者体内都可以找到有效的能够被识别的新生抗原。一时之间，新生抗原成为免疫治疗中冉冉升起的新星。
新生抗原激活免疫系统
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新生抗原的特点
①肿瘤细胞所特有，正常的组织和细胞中没有。
②具有免疫原性，可以激活免疫细胞，被免疫系统识别。
新生抗原是面向所有类型肿瘤的靶向特定抗原，故更具特异性、有效性及低毒性，它们在肿瘤上的选择性表达可以最小化免疫耐受性以及自身免疫的风险。
具有单一显性突变的癌症通常可以通过该靶向显性驱动突变来有效治疗。美国ASCO前会长George Sledge将此类癌症称为“愚蠢的癌症”，因为他们对靶向治疗敏感。相比之下，“聪明的癌症”具有更高数量的突变，多个同时发生的驱动突变，并且不太适合使用传统靶向治疗。然而，这些具有高突变负荷的“聪明的癌症”常常具有高表达的异常蛋白。在目前的免疫治疗时代，这些异常蛋白质越来越被认为是免疫系统识别和控制肿瘤生长的机会。
新生抗原总体上也可以分为两类：共有的和独有的。共有的新生抗原是指不同类型的肿瘤以及不同的患者之间共同存在的突变抗原，且在正常基因组中并不存在。免疫原性高的共有新生抗原可能会被筛选用作广谱的治疗性癌症疫苗，用于那些有相同突变基因的患者。但是人类肿瘤中大部分有意义的突变均不在患者之间共享，患者与患者、肿瘤与肿瘤之间的突变是不同的，因此大部分新生抗原被认为是患者特有的，所以研究T细胞对基因突变产生的新生抗原的反应活性需要基于单个肿瘤的基因组。大多数新生抗原由特定的突变引起，特异性识别和靶向相应的肿瘤具有一定的技术难度，导致这一方法难以广泛开展。如今，通过DNA测序、抗原决定簇测试等方法，这一技术难题正在被克服。随着二代测序技术的发展，识别单个肿瘤基因组编码区中存在的突变变得相对容易，使得预测潜在的新生抗原成为可能。由于同一肿瘤的基因突变可能有广泛的不同，这构成了肿瘤个体化免疫治疗必要性的重要基础。我们可以说，利用新生抗原制备的肿瘤疫苗是真正意义上的个体化治疗。
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新生抗原的形成
基因组测序的最新进展表明，在发生和进展过程中，肿瘤获得了数十至数千种不同的体细胞突变。大多数突变不会产生内在的生长优势，且通常是肿瘤内基因组不稳定的结果，称为乘客突变（Passenger Mutation）。少数突变会干扰正常的细胞调节，并有助于促进肿瘤生长和对靶向治疗的抵抗，称为驱动突变（Driver Mutation）。迄今为止，已经鉴定出大约140种可以驱动肿瘤发生的基因。然而，驱动突变和乘客突变都可以改变氨基酸编码序列，统称为非同义突变，导致肿瘤细胞表达正常细胞不表达的突变蛋白。这些异常蛋白质序列被加工成短肽并被主要组织相容性复合物MHC呈递到细胞表面，从而可以被T细胞识别为非己抗原，引起T细胞活化，帮助T细胞识别并杀伤肿瘤细胞，促进免疫系统特异性靶向肿瘤。具体可总结为：
体细胞突变→转录成mRNA→蛋白酶加工突变蛋白→TAP介导的肽段转运进入内质网腔→与MHC复合物结合产生新的抗原→T细胞识别细胞表面新生抗原，激活T细胞，引起免疫反应。
肿瘤抗原加工和呈递
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TNB和TMB的关系
TMB（tumor mutational burden）即肿瘤突变负荷，指的是肿瘤患者肿瘤细胞内编码区体细胞基因突变的数量。一旦发生体细胞突变，非同义突变会改变氨基酸编码序列，导致肿瘤细胞表达正常细胞 所没有的异常蛋白，如果异常的蛋白能够转移到膜表面并被MHC递呈，且可被活化的T细胞所识别，即为新生抗原。
TNB指标目前可作为TMB指标的一个辅助指标。一般来说，TMB越高，产生肿瘤新生抗原的可能性就越大，肿瘤细胞与正常体细胞越不相同，越容易激活免疫反应。简而言之，TMB升高会增加产生免疫原性肿瘤新生抗原的机会。
肿瘤体细胞突变率与其对免疫检查点抑制剂的敏感性
虽然难以全面评价应用免疫检查点抑制剂（如PD1/PDL1检查点抑制剂）治疗肿瘤的效果，但是大量临床实验表明，同一类型的肿瘤，体细胞突变率及随后形成新生抗原的潜能均与其对免疫检查点抑制剂的敏感性正相关，可通过高相对反应率ORRs来衡量。综上所述，肿瘤体细胞突变率及接下来形成新生抗原的潜能与其对免疫检查点抑制剂的敏感性有关并预示着肿瘤对免疫治疗的敏感程度。
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影响新生抗原产生的因素——TMB
1.突变数量
基于WES测序，我们可以测出体细胞突变的数量。TMB越高，能够被T细胞识别的新生抗原数量越多，肿瘤部位的免疫杀伤活性越大。
肿瘤TMB及产生新生抗原的可能性
上图展现了个体肿瘤中体细胞突变的数量，右边纵轴展示了不同肿瘤新生抗原形成的可能性。其中编码DNA的体细胞突变值为10muts/Mb，对应表达基因中大约150个非同义突变。
可以得出的结果是：大多数黑色素瘤患者的TMB>10，能够产生更多有效的新生抗原。基于这些数据,可以预计：如果肿瘤中TMB>10，那么会产生比较多的新生抗原；如果肿瘤中1<TMB<10,仍然有可能携带新生抗原；如果肿瘤中TMB<1，通常很难产生可以被T细胞识别的新生抗原。TMB水平高（>10）的肿瘤患者，代表其肿瘤细胞表面的肿瘤新生抗原数量更多，免疫细胞能对肿瘤细胞产生更有效的杀伤作用，同时肿瘤患者能对免疫检查点抑制剂药物有更好的治疗响应。
2.突变类型
与原编码序列差异越明显的突变越容易产生被T细胞识别的新抗原。插入/删除及移码突变导致氨基酸序列和空间结构改变会比较大，与MHC分子结合的亲和力会更强，被T细胞识别的可能性越大。
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影响新生抗原质量的因素——HLA 基因型
新生抗原为肿瘤细胞特异表达的突变多肽，可以帮助 T 细胞有效识别肿瘤细胞；而MHC分子负责与抗原结合形成复合物，将抗原呈递到肿瘤细胞膜外，被细胞毒性T细胞识别并杀伤，促进免疫系统特异性靶向癌细胞。TMB影响新生抗原产生的可能性，而MHC与肽段的结合则影响到其作为抗原的质量。与MHC高亲和力结合的新生抗原，免疫应答的可能性会更高。
MHC（major histocompatibility complex）,主要组织相容性复合体，在人类又称人类白细胞抗原（human leucocyte antigens, HLA）复合体，是位于人类第6号染色体短臂上的一组紧密连锁的基因群。HLA是具有高度多态性的同种异体抗原，由一条α重链（被糖基化的）和一条β轻链非共价结合而成。HLA抗原参与调节免疫应答，并对抗原进行加工处理，协调细胞和体液免疫。
HLA 共有4型，参与抗原呈递和免疫应答的两种主要类型的HLA分子是I类和II类分子。当抗原在细胞内部时，它们被切割成肽，与HLA分子结合，HLA分子将短肽呈递给T细胞以启动适应性免疫应答。HLA-I类分子呈递内源性多肽至细胞表面，在细胞表面被CD8+ T细胞识别。HLA-II类分子呈递外源性多肽至细胞表面，在细胞表面被CD4+ T细胞识别。
影响HLA分子功能的因素有：
1.多态性
HLA分型被定义为I类和II类基因座的多态性。HLA分子允许存在多种抗原或等位基因，这种多态性使得HLA分子中的氨基酸在不同个体中存在微小差异，产生这些差异的多态性进而产生了不同的HLA类型。HLA-I类分子多态性主要表现为多肽结合区（即抗原结合口袋）序列的多样性。每个个体表达6种MHCI类分子，由位于6号染色体上的2个同源重组拷贝中的3个基因（HLA-A，HLA-B和HLA-C）编码。
研究发现HLA基因体细胞突变率的增高与HLA功能异常显著相关，是免疫逃逸的潜在机制，参与肿瘤形成和肿瘤进展。研究还发现，HLA基因功能缺失变异（如移码突变、无义和剪接位点突变）可能会导致肿瘤细胞HLA-I类表达缺失，从而影响抗原呈递给免疫细胞。
HLA的多态性越强，能呈递的新生抗原的种类就越多，免疫药物的疗效就越好；相比于至少一个基因座呈纯合状态的患者，HLA-I三个基因座全部呈杂合的患者，预计可以呈递更多样化的肿瘤新生抗原；HLA-I 三个基因座全部杂合的癌症患者总生存期OS优于存在纯合等位基因的患者；HLA-I类分子在至少一个基因座表现出纯合与更差的预后相关。
HLA纯合与杂合基因座患者OS对比
如图所示，绿色曲线代表 HLA 基因座全部为杂合状态的患者生存率，蓝色曲线代表 HLA 基因座至少有一个为纯合状态的患者生存率。两组临床试验结果表明，HLA 基因座全部为杂合状态的患者生存率更高，P 值均小于 0.05。说明 HLA 多样性越高，患者生存率越高。
2.HLA LOH（ HLA杂合性缺失）
HLA LOH指HLA成对等位基因丢失其中一个等位基因50%以上的基因组序列。HLA的功能是将新生抗原呈递到细胞表面供T细胞识别，故一旦功能部分或者完全缺失，会导致抗原呈递能力缺失，免疫系统无法识别肿瘤，肿瘤可能会发生免疫逃逸，即患者存在对免疫药物耐药的风险。HLA LOH阳性，即HLA基因存在杂合性缺失或功能完全缺失。
免疫逃避是癌症的一个特征。因为HLA缺失而失去HLA呈递抗原的能力可能会促进免疫逃避。然而，该位点的多态性使HLA拷贝数分析无法准确。有文献提出了计算人类白细胞抗原杂合性缺失的工具-LOHHLA，从测序数据中确定HLA等位基因特异性拷贝数。使用LOHHLA，我们发现40%的非小细胞肺癌(NSCLCs)都存在HLA LOH，且与高亚克隆新生抗原负荷、APOBEC介导的突变、细胞水解活性的上调和PD-L1阳性有关。HLA LOH改变的局灶性、亚克隆频率、转移位点的富集以及平行事件的发生提示HLA LOH是一种免疫逃逸机制，在肿瘤进化后期受到强大的微环境选择压力。用LOHHLA来描述HLA LOH可以改进目前计算软件对新生抗原的预测，可能对我们理解新生抗原的耐药机制和免疫治疗方法有意义。
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