大家好~，今天小编为大家带来的文献是发表在《Frontiers in Immunology》上的Activation of the DDR Pathway Leads to the Down-Regulation of the TGFβ Pathway and a Better Response to ICIs in Patients With Metastatic Urothelial Carcinoma。

背景介绍

1. 尿路上皮癌

尿路上皮癌是膀胱癌（BC）的一种，约占BC的80%，起源于移行上皮细胞。目前，铂基化疗依旧是恶性UC患者的一线治疗方案，但近一半的患者在治疗后出现进展或复发。随着免疫治疗的兴起，UC具有的高TMB以及免疫原性为免疫治疗提供了可行性，2016年FDA批准了5种免疫检查点抑制剂(ICIs)用于治疗顺铂耐药晚期UC，其中atezolizumab和pembrolizumab被批准作为顺铂耐药mUC的一线治疗药物(其他3种是nivolumab、durvalumab和avelumab)。

2. DNA损伤修复（DDR）通路

DNA损伤修复（DDR）通路是细胞的一种监督机制，与损伤DNA的修复以及维持基因组整倍性以及稳定性密切相关。本文中，作者将DDR通路定义为8个子集通路的总称（如下表），各通路之间相互联系，形成互作网络。

DDR通路	单链DNA损伤修复通路	base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), mismatch repair (MMR), and single-stranded DNA binding (SSB)
DDR通路	双链DNA损伤修复通路	nonhomologous end joining (NHEJ), homologous recombination (HR), the Fanconi anemia (FA) pathway and double-strand break repair (DSB)

DDR通路在UC的发生演化中发挥着重要作用，与UC患者的临床预后密切相关。有研究指出：在使用顺铂治疗的晚期BC患者中，DDR通路的基因突变与良好的临床预后相关；MMR通路中的MSH4基因突变与ICI治疗后转移性BC患者的完全缓解密切相关。

3. 研究背景

虽然免疫治疗为UC患者带来比化疗更好的疗效，但是只有20-30%的UC患者对ICI疗法有良好应答。此外，ICI治疗可在部分患者中免疫相关不良反应(irAEs)。所以，需要更多的研究来确定行之有效的生物标志物，筛选免疫治疗获益人群。目前，TMB、NAL（tumor neoantigen load)、PD-L1表达水平，MSI，TME标志物和T细胞基因表达谱（GEPs）已经在多种癌症患者的免疫治疗疗效以及预后预测中使用。
上述DDR通路的两项研究结果表明，DDR通路和ICI治疗反应之间有很强的联系。然而，DDR通路的激活水平如何影响UC患者的免疫治疗，还有待进一步探索。
因此，本文作者研究了DDR通路激活水平与mUC患者免疫治疗疗效之间的关系。首先将三个数据集中的患者都按DDR通路激活水平进行分组，总结基因组和临床特征，通过生存分析以及免疫治疗应答人群的比较发现了DDR通路的预测价值和预后价值，又从肿瘤免疫原性、免疫微环境角度证明了自己的发现，并探究潜在的机制，通过GSEA富集分析，引出TGFβ信号通路激活与DDR通路激活之间的关系，并通过膀胱癌细胞系的药敏分析进一步探讨TGFβ通路抑制剂对肿瘤细胞的作用。其中Mvigor210数据集为主要的训练集，TCGA-BLCA作为外部验证队列，GSE78220则作为免疫治疗验证队列。

研究流程

队列介绍

IMvigor210（n=348）	IMvigor210CoreBiologies包中接受atezolizumab治疗的转移性尿路上皮癌（mUC）患者队列
TCGA-BLCA（n=408）	Xena数据库的膀胱癌患者队列
GSE78220	接受派姆单抗或尼鲁单抗(PD-1阻滞剂)治疗的转移性黑色素瘤患者队列

结果概览

1. 发现DDR通路的潜在预测价值

首先，作者在mUC cohort和TCGA-BLCA cohort两个队列中分别做了DDR通路的ssGSEA分析，并根据通路的ES中位值将患者分为DSSH组（DDR通路激活水平高组）和DSSL组（DDR通路激活水平低组），在这两组中，比较临床特征、TMB、NAL以及DDR通路相关基因的突变率，结果如下：

将RNA-seq数据TPM化后，使用GSVA包进行单样本基因集富集分析(ssGSEA)，用ssGSEA ESs来反映样本中通路的激活水平，并使用中位数来确定进一步分组的激活水平。

然后对TCGA-BLCA队列的DSSH组和DSSL组的DDR相关基因突变模式进行分析，如图：

结果：

mUC队列：DSSH组的TMB和NAL比DSSL组更高(TMB, p=0.043; NAL, p=0.00029)
TCGA-BLCA 队列：DSSH组的TMB比DSSL组更高(p=0.019)
DDR相关基因突变率：TP53基因在DSSH组的突变率高于DSSL组(mUC队列，p=0.099;TCGA组,p = 9.9 e-06)。此外，在两个队列中，DDR相关通路中的基因突变大多为错义突变，其次为无义突变。
TCGA-BLCA队列中DSSH和DSSL组的突变主要为C>G和C>T突变。

然后，作者又在mUC队列、转移性黑色素瘤患者队列（GSE78220）及TCGA-BLCA队列的DSSH组和DSSL组中进行了生存分析，用来评估DDR通路的激活程度与免疫治疗预后之间的关系。K-M曲线如图。此外，作者对各个DDR通路子集也分别做了生存分析（见补充图），且结果与DDR通路类似。

结果：

mUC队列以及GSE78220队列均显示DSSH患者有更好的免疫治疗预后。即DDR通路的高水平激活能改善mUC患者的免疫治疗疗效。
TCGA-BLCA队列生存分析结果并没有显著的统计学差异，可能是因为该队列患者接受的是传统化疗而不是免疫治疗有关，侧面印证了DDR通路激活水平作为免疫治疗疗效预测因子的可行性。

根据患者免疫治疗应答结果，作者又将mUC队列患者分成了应答组（CR或者PR）和无应答组（SD或者PD），并在DSSH组和DSSL组中比较应答者数量的差异，还比较了各项病理临床特征。如下图。此外还做了各个DDR子集通路激活水平高低与应答者数量之间的比较（补充图3）。在转移性黑色素瘤队列中，作者也比较了DDR通路以及各个子集的激活水平与应答者数量之间的关系（补充图4B)，但得到的是阴性结果。

结果：

mUC队列中，DSSH组有更好的ICI应答率、更好的BOR、更高的PD-L1表达以及更多的炎症免疫表型，说明DSSH组有更好的抗肿瘤免疫应答。各DDR通路子集的分析也有类似结果。

2. 肿瘤的免疫原性以及肿瘤免疫微环境分析

在mUC队列和TCGA-BLCA队列中，比较DDR通路以及各子集通路的激活水平与NAL水平的关系，如图。

结果：

DDR通路以及各下游通路激活水平高组有更高的NAL水平

接着，作者在TCGA-BLCA队列中，做了各DDR通路的子集通路与肿瘤基因组特征关系的相关性分析：

结果：

片段数、改变率、非整倍性评分和同源重组缺陷评分与DDR通路以及绝大部分DDR子集通路的激活水平显著正相关，说明DSSH组具有较高的基因组不稳定性。

因为肿瘤微环境（TME）在膀胱癌的发生发展中起重要作用，作者假设DDR通路的激活可能通过影响TME来促进ICI疗效，然后分析了DSSH组和DSSL组肿瘤微环境的浸润性淋巴细胞（TIL）比例以及基质细胞比例，又根据CIBERSORT算法，比较了每个患者22种免疫细胞的相对富集程度：

结果：

DSSH组有更高的TIL比例以及更低的基质细胞比例
在mUC队列中，DSSH组激活的记忆性CD4 T细胞(p=0.0021)、激活的自然杀伤细胞(NK)细胞(p=0.017)和M1巨噬细胞(p=0.044)的比例显著高于DSSL组，而单核细胞的比例显著低于DSSL组(p=0.011)。
在TCGA-BLCA队列中，DSSH组激活的记忆CD4 T细胞(p=0.032)、静止NK细胞(p=0.0032)和激活的肥大细胞(p=2.3e-5)比例显著高于DSSL组，而Treg细胞(p=7.8e-6)和单核细胞(p=3.6e-3)比例显著低于DSSL组。

接着，作者比较了TCGA-BLCA队列DSSH组和DSSL组的免疫相关基因的表达水平，以及TCGA亚型和免疫亚型的分布情况。

结果：

具有免疫激活功能的基因，如TNF、IL1和CXCL10 (logFC>0.5，校正p<0.05)在DSSH组中显著上调，而具有免疫抑制功能的基因，如IL4、IL13和IL10在DSSH组中显著下调(logFC< -0.5，校正p<0.05)。
DSSH组有更多的BLCA-2型和更少的BLCA-3型患者(Fisher精确检验:p=9.7e-5).
DSSH组中C2 (IFN-g显性)患者多于DSSL组；DSSL组中C3(炎症性)患者多于DSSH。(Fisher精确检验:p=2.1e-6)。

根据以往的研究，CD4 T细胞与有效抗肿瘤免疫反应的产生有关，而Treg细胞通过在肿瘤微环境中分泌细胞因子IL10和TGFβ来抑制抗肿瘤免疫微环境。以上结果提示，DDR通路的高水平激活可能提高mUC的肿瘤免疫原性，从而增强抗肿瘤活性。

3. DDR通路激活改善ICI治疗的机制探索

作者在这部分进一步探讨DDR通路激活水平高的mUC患者从ICI治疗中获益的可能机制。首先做了mUC队列和TCGA-BLCA队列DSSH组和DSSL组的差异表达分析，DDR相关通路、TGF β相关信号通路和细胞增殖通路中核心基因的差异表达谱如下图。

然后，又在DSSH组和DSSL组中做了以上通路的GSEA分析：

结果：

DSSH组TGF β相关信号通路显著下调，细胞增殖相关通路显著上调
TGFβ信号通路在许多生物过程中发挥调控作用，包括细胞生长、细胞分化、凋亡、转移和癌症进化。虽然TGFβ及其信号通路的激活在癌症早期发挥了抗肿瘤作用，但这些通路促进EMT和血管生成，介导免疫抑制促进肿瘤进展和转移，此外，许多恶性肿瘤会产生过量的TGFβ从而促进自身的恶性程度。

然后作者又分析DDR通路的激活水平与TGF-β反应水平之间的关系：

从GDSC (Genomics of drug sensitivity in Cancer)数据库下载了BC细胞系的药敏数据和基因表达谱数据，将基因表达谱矩阵标准化，采用ssGSEA方法计算各细胞系的ES，并对细胞系进行分组。选择三种转化生长因子β (TGFβ)信号通路抑制剂进行药敏分析。从MSigDB中收集TGFβ信号通路的基因集，通过ssGSEA量化激活水平。

作者发现，在TCGA-BLCA队列中，DDR通路抑制的患者表现出TGF-β反应水平显著升高；而在mUC队列中，DDR通路的激活和TGFβ信号通路的激活与TGFB3、ACVR1、TGFBR2等核心基因的表达呈显著负相关。

然而，膀胱癌细胞的药敏分析表明，三种TGFβ信号通路抑制剂在BC细胞系中的半最大抑制浓度(IC50)值并没有因DDR通路的激活而有显著差异（补充图6），这可能与BC细胞系肿瘤组织缺乏肿瘤免疫微环境有关。

小结

本文作者从转录组的角度论证了DDR通路在预测mUC患者ICI疗效方面的具体价值。以往研究大多从DDR基因突变的角度预测ICI疗效，但在临床实践中，虽然DDR基因突变相对容易检测，但大多数患者只能接受使用ctDNA对数百个基因进行靶向基因测序，而这种靶向基因测序并不如全基因组测序(WES)准确。所以，考虑到DDR突变的不同突变类型或突变位点分类对预测能力的影响并不十分明确，从DDR通路的整体激活水平预测ICI的治疗效果为研究提供了一个新的角度，并且具有独特的优势。

最后，虽然作者成功地发现DDR通路的激活水平可能是mUC患者ICI治疗反应的有效预测因子，但也指出了文章的局限性：

没有在接受免疫治疗的mUC患者中验证文章的发现，而是用转移性黑色素瘤队列来观察DDR ES是否可以预测ICI治疗其他癌症的结果；
功能富集分析的结果需要进一步的体内和体外验证；
没有找到一个统一的cut off值来进行DDR通路激活水平的分组，采用的是DDR通路和DDR相关通路ES的中位数。

好了，今天的分享到这里就结束了~，我们下次再见！

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