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流程图：
首先，给大家展示一下本研究的流程图，是不是看起来分析还是比较简单呢？用的也就是我们平常常见的分析方法，但怎么样就发到5分了呢？我们一起来看看吧。
结果
结果一：癌症相关成纤维细胞（CAFs）丰度是一个与膀胱癌（BLCA）进展相关的预后因素
首先，作者利用MCP-counter算法计算了TCGA队列中CAFs的丰度，结果发现在肿瘤微环境中，CAFs的丰度比其他类型的细胞都高（图1a），并且与stromal store、immune score、ESTIMATE score显著相关（图1b）。并且，高水平的CAFs与BLCA患者的不良预后相关（图1c）。作者还发现，CAFs与BLCA 临床因素grade、stage、T classification、淋巴结转移相关（图1d-g）。进一步用GEO队列数据进行验证，得到的结果与TCGA结果一致（图2a-c），说明CAFs丰度是BLCA一个不良预后因素，且会促进BLCA的进展。
结果二：Hub基因筛选以及富集分析
根据CAFs中位值，将样本分为高低CAFs组，筛选差异表达基因（DEGs）。在TCGA和GEO数据库中共分别筛选到555和187个DEGs（图3a-b）。WGCNA结果显示，在TCGA队列中，筛选出黄色模块与CAFs显著相关（图3c）；在GEO队列中，筛选到蓝色模块与CAFs显著相关（图3d）。进一步将TCGA和GEO队列中筛选得到的DEGs和模块基因取交集，得到的交集基因即作为hub基因。如图4a所示，总共得到了74个hub基因（图4a）。对得到的74个hub基因进行富集分析，结果显示，这些基因涉及细胞外基质重塑功能（图4b-c）。
结果三：筛选与CAFs相关的关键基因
在这里，对在TCGA和GEO队列中筛选得到的hub基因进行单变量Cox回归分析，结果显示，在TCGA和GEO队列中分别有22和10个基因与预后相关（图4d-e），且发现两个队列中有3个基因重叠（图4f），包括CALD1、COL18A1、TNC。作者在这里对这3个基因和CAFs的标志性基因进行相关性分析，结果发现，这3个基因与这些标志性基因相关（图4g）。在这里，作者后续以CALD1为主进行分析。GSEA分析结果发现，在hallmarkers基因集中，CALD1参与上皮间充质转化和缺氧相关途径（图4h）；KEGG基因集中，CALD1参与多种微环境重塑途径，以及免疫相关途径（图4i）。
结果四：CALD1、整体生存（OS）、临床因素之间的关系，以及肿瘤微环境
在TCGA队列，发现高表达CALD1与患者不良预后相关（图5a）。为了验证CALD1的预测性能，构建了ROC曲线，结果发现AUC值为0.679（图5a）。再者，作者还发现，CALD1的表达水平与临床因素stage、T、N classifications显著相关（图5a）。还发现，高CALD1的表达水平组中CAFs、巨噬细胞、stromal、immune、ESTIMATE scores相比于低CALD1的表达水平组都显著升高（图5b-c）。这些结果说明，CALD1可能通过CAFs和巨噬细胞共同调节BLCA基质和免疫微环境。
结果五：肿瘤浸润免疫细胞及免疫检查点
利用CIBERSORT算法计算TCGA队列中患者的22种免疫浸润细胞比例（图6a）。并且还发现，CALD1与巨噬细胞（M0，M2）显著正相关，与CD8 T细胞显著负相关（图6b）。并且，比较了高低CALD1表达组22种免疫细胞的比例，同样发现在高CALD1表达组，巨噬细胞（M0，M2）相对水平升高，CD8 T细胞相对水平降低（图6c）。再者，作者还分析了高低CALD1表达组免疫检查点相关基因的表达，结果发现所有的免疫检查点相关基因在高CALD1表达组都是升高的（图6d-e）。同时，作者还在GEO队列中进行了验证，结果与TCGA队列结果基本一致（图7a-e）。
结果六：临床样本验证
为了验证上述分析结果的准确性，作者收集了40份BLCA患者的样本进行免疫组化分析。结果发现，高表达的CALD1与BLCA高grade和stage相关（图8a-b）。并且还发现，CALD1与CAFs的标志物ACTA2及M2巨噬细胞的标志物CD206共表达（图8c）。结果表明，CALD1与CAFs和巨噬细胞相关，进而影响BLCA的进展。
总结：
怎么样，一起看完这篇文章，有没有发现其实分析思路也是比较简单的，分析方法也比较常见，主要就是免疫浸润 WGCNA，那怎么样发到了5 呢？小编总结了一下本研究的几点优势：第一，本研究从CAFs细胞出发，目的明确，不但一步步缩小范围分析了在BLCA中与CAFs相关的关键基因，并且进一步分析了其中可能涉及的机制，可能与巨噬细胞相互作用，促进BLCA发展；第二，本研究用了3个独立的数据集，其中包括临床样本，所以得到的结果更可靠、更有说服力。这个套路，也可以换成其他免疫细胞和其他类型的癌症，可重复！快点行动起来吧~
文献出处：
Du Y, Jiang X, Wang B, Cao J, Wang Y, Yu J, Wang X, Liu H. The cancer-associated fibroblasts related gene CALD1 is a prognostic biomarker and correlated with immune infiltration in bladder cancer. Cancer Cell Int. 2021 May 29;21(1):283. doi: 10.1186/s12935-021-01896-x. PMID: 34051818; PMCID: PMC8164301.
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