2022年9月，圣裘德儿童研究医院的Douglas R.Green团队在《Cell》上发表了题为“Sublethal cytochrome c release generates drug-tolerant persister cells”的文章。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.07.025
文章中用于荧光辅助细胞筛选分析的GFP-Booster Alexa Fluor® 488、RFP-Booster Alexa Fluor® 568，以及用于免疫沉淀的GFP-Trap® Magnetic Agarose均来源于Proteintech旗下品牌Chromotek。
研究内容
细胞凋亡可被外在死亡受体途径和内在线粒体途径诱导。其中内在线粒体途径的关键步骤是线粒体外膜通透性改变，该过程由BCL2家族效应蛋白BAX、BAK、BOX负责。
线粒体外膜渗透（MOMP）发生后，线粒体蛋白（如细胞色素c）被释放到胞质，激活caspase启动细胞凋亡。促凋亡BH3-only蛋白利用其BH3结构域结合BAX和BAK从而参加MOMP。BH3类似物也是通过此功能促进细胞凋亡。
作者此前的研究发现凋亡级联的启动不一定导致细胞死亡，不完全MOMP（iMOMP）提供了完整线粒体，能够抵抗细胞死亡。对此现象，研究团队展开了深入的探索。
作者使用BH3类似物ABT-737和S63845（S6）处理野生型（WT）、双敲DKO（BAX和BAK）和三敲TKO（BAX、BAK和BOK）细胞，通过活细胞量化实验确定了BH3类似物的最大靶向剂量（图1 A）。通过BH3类似物处理后不同时间的药物敏感性对比，证明细胞耐受的持续状态是短暂的（图1 B）。
随后作者在体内检测亲代细胞（PT）和持久性细胞（PS）的表现。首先使用BH3类似物刺激人结肠癌细胞HCT116产生PC9持久性细胞，然后通过NSG小鼠的尾静脉注射，比较未处理PT和PS的肺定殖能力，发现肺定殖主要由PS产生而非PT（图1 C）。同样，尾静脉注射荧光素标记细胞的活体检测显示，PS注射后的小鼠肿瘤负荷明显高于PT（图1 D-E）。
为了更好的体内验证效果，作者设计了肺肿瘤的活体原位模型。通过不同染料标记的PS和PT注入受体动物的左肺（图1 F）。结果证明体内PS的增殖效率和侵入性都高于PT（图1 F-G）。
那使用BH3类似物产生的PS是否会导致对其他癌症疗法的交叉耐药呢？作者发现使用不同的癌症治疗药物处理PS的活性均明显增加（图1 H）。
PS的表型特征之一是依赖于脂质过氧化物酶GPX4。作者也使用GPX4抑制剂RSL3验证了PS对GPX4的依赖性（图1 I）。
为了获得不同治疗方法产生的PS共同特征，作者进一步使用RNA-seq分析这些细胞的共同基因表达特征，发现了转移与侵袭、细胞应激反应、上调的炎症信号和EMT、下调的脂肪酸代谢、氧化磷酸化和mTORC1信号（图1 J）。因此，使用BH3类似物生成的PS和在不同条件下产生的耐药PS具有相同的基因表达和表型特征。
图1 靶向抗凋亡蛋白Bcl-2诱导持久性细胞
BH3类似物能够将BCL-2效应蛋白与抗凋亡蛋白解离并引起MOMP。为了确定BCL-2效应蛋白对持久表型的重要性，将BAX、BAK和BOK敲除的细胞（TKO）和WT细胞进行比较。实验证明PS的肺定殖能力（图2 A）及其转移潜能（图2 B）取决于BCL2效应蛋白。此外，BH3类似物处理前后的TKO细胞对RSL3诱导铁死亡的敏感性相同（图2 C）。
为了找出可能参与持久性表型的下游通路，作者将对照组（MOCK）或BH3模拟物处理的WT和TKO细胞进行了RNA-seq。BAX-、BAK-、BOK-依赖性差异表达基因（DEGs）的富集分析证实了这些通路对BCL-2效应蛋白的依赖（图2 D），如NF-kB信号通路和EMT上调、mTORC1信号通路和脂肪酸代谢下调，另外也发现了其他通路变化包括白介素信号转导和“EIF2AK1（HRI）对血红素缺乏的反应”（图2 E-F）。有趣的是许多DEGs已证实与转移、血管生成和癌症免疫逃避有关（图2 G）。
进一步对EMT和细胞周期通路的前10个变化的DEGs进行分析，找出与持久表型相关的潜在基因（图2 H）。在GSH代谢途径中下调的DEGs只在WT PS中发现，TKO细胞未发现（图2 I）。
图2 持久性表型很大程度上依赖于Bcl-2效应蛋白
为了进一步了解持久性表型的产生机制，作者对BH3类似物处理后1、3和7天后的PS（分别为PS1D、PS3D和PS7D）和相应的PT进行了单细胞RNA-seq。UMAP（均匀流形近似与投影）分析揭示PS在BH3类似物处理时间越长，表型趋势越接近PT（图3 A）。有趣的是，拟时序分析中较早激活的基因簇显著富集在EMT通路和综合应激反应（ISR）中（图3 B-C）。
相反，后期的基因簇（2和4）则富集了与DNA复制和细胞周期进程相关基因，两者都是后期PS和PT的标志。PS1D中的ISR相关基因上调在随后几天逐渐回落（图3 D），也符合PS持久表型的短暂性。
图3 转录组分析显示在BH3类似物持久性基因中存在短暂的ISR表达谱
ISR是否与MOMP和持久性表型有关是作者接下来的方向。已有研究显示ISR的触发依赖于控制蛋白翻译起始因子eIF2α的磷酸化，四种激酶（EIF2AK1/HRI、EIF2AK2/PKR、EIF2AK3/PERK和EIF2AK4/GCN2）响应不同的上游刺激，启动翻译重编程。在这其中激活转录因子4（ATF4）能够在短期内激活相关基因表达通过增加营养吸收、自噬和抑制氧化应激来促进生存。
在BH3类似物处理1小时后观察到eIF2⍺的磷酸化和ATF4的表达上调，该结果与转录学结果一致证实ISR参与了该过程（图4 A）。共聚焦成像也证明PS比PT的核ATF4蛋白表达水平更高（图4 B-D）。
此外作者通过设计ATF4翻译报告器明确了BH3类似物诱导的PS会刺激ATF4表达上调，同时TKO细胞则并没有检测到信号（图4 E-F）。
为了了解caspase激活是否与ATF4激活相关，作者使用BH3类似物处理Casp9敲除细胞。这类细胞不能激活caspase级联反应，但是在处理后仍然能检测到ATF4的信号（图4 G）。
凋亡酶激活因子APAF1敲除细胞和casp9敲除细胞都能在BH3类似物处理后检测到ATF4的表达（图4 H）。Pan-caspase抑制剂Q-VD-OPh处理的细胞也能检测到（图4 I）。表明ATF4的激活独立于caspase激活。
最后作者还发现eIF2⍺激酶中HRI（EIF2AK1）负责eIF2⍺磷酸化和ATF4翻译（图4 J-K）。因此，BH3类似物通过HRI诱导ISR，这一过程依赖于BCL-2效应器（BAX、BAK和BOK），但不依赖于caspase激活。
图4 BH3类似物诱导BCL-2效应子依赖性ISR，独立于caspase激活
PS的产生依赖于BAX和BAK，这表明存活细胞中的iMOMP可能是ISR激活的必要条件。
作者利用分裂-超折叠GFP（sfGFP）系统（图5 A-B）设计了一种报告基因，以揭示线粒体通透性。在PS细胞中使用该系统可以检测到GFP信号增加（图5 C），而沉默BAX和BAK后信号与MOCK组一致（图5 D）。
作者发现ATF4蛋白表达的激活与PS中MOMP的程度相关。GFP高的细胞经历了更广泛的亚致死MOMP，ATF4表达更高（图5 E）。此外，GFP高的PS呈现更好的迁移潜力（图5 F）。这些结果说明BCL-2效应蛋白在MOMP中的作用：促进ATF4的表达并增加PS在体内的迁移。
此外WT细胞在BH3类似物或Raptinal处理后显示eIF2⍺磷酸化和ATF4表达（图5 G），而TKO细胞仅在Raptinal处理后显示eIF2⍺磷酸化和ATF4表达（图4 F，图5 H）。并且，MOMP不依赖凋亡和caspase激活，依旧能维持PS的迁移能力（图5 I-J）。
图5 亚致死性MOMP对ISR的激活至关重要
细胞色素c（由CYCS编码）在MOMP后APAF1和caspase的激活中起关键作用。干扰CYCS会显著降低了BH3类似物处理后ATF4的表达（图6A）。在胞质提取物中添加细胞色素c会导致caspase激活和eIF2⍺磷酸化，而HRI敲低后，检测不到eIF2⍺磷酸化（图6 B-C）。
接下来，作者想知道不能激活APAF1（即不能诱导凋亡）的细胞色素c K72R突变体在BH3类似物处理后能否激活ISR。结果是表达WT和K72R突变体的细胞都检测到ATF4的表达（图6 D）。干扰HCCS（细胞色素c合成酶）也导致BH3类似物处理后ATF4的合成受阻（图6 E）。因此细胞色素c是激活HRI的关键。
药物实验发现细胞色素c缺失的细胞表现出药物敏感性，而WT和K72R突变体表现出耐药能力（图6 F-G）。此外，表达细胞色素c K72R突变体的PS显示出更强的转移潜力（图6 H）。因此，BH3类似物诱导产生PS的能力依赖于细胞色素c，但不依赖于其诱导凋亡的能力。
在PS中依赖BAX和BAK调控的基因也依赖CYCS。作者发现与GSH代谢有关的基因RSL3依赖于CYCS，调控其表达（图6 I）。参与GSH降解的CHAC1仅在细胞色素c存在的情况下表达上调。与CHAC1竞争以阻止GSH降解的CHAC2则以细胞色素c依赖的方式下调。与之类似，CREB5、ATF3、PDK1和PTGS2几个基因的表达也与CYCS相关（图6 J）。
随后作者发现细胞色素c的加入会使得eIF2⍺的磷酸化程度增加（图6 K）。同时细胞色素c能够解除hemin对HRI的抑制作用（图6 L）。通过免疫共沉淀，作者进一步证明了证明了细胞色素c和HRI的相互作用（图6 M）。因此细胞色素c释放后直接与HRI相互作用，激活ISR反应。
图6 细胞色素c激活HRI并参与持久表型
ATF4是维持持久性表型的关键蛋白。用BH3类似物处理ATF4沉默的细胞后，EMT通路显著上调（图7 A）。ATF4的缺失导致了显著的治疗敏感性，并减少了PS在不同细胞系中的发生（图7 B），而与应激相关的其他因子NRF-2和HO-1则变化不大。早期PS与PT相比对2BAct的更敏感（图7 C）。用BH3类似物处理ATF4缺陷细胞，存活细胞暴露在多种促凋亡抗癌药物中，发现它们的药物敏感性比ATF4-/- PT相同甚至更高（图7 D）。
BAX的缺失可导致耐药产生。作者通过沉默PC9细胞中的BAX、BAK或BOK基因，证明单独缺失BAX基本上能消除对药物的敏感性（图7 E）。BAX的降低依赖于细胞色素c依赖性的ISR激活。作者检测了用BH3类似物处理的CYCS-、ATF4-和HRI-缺陷细胞（图7 F-G），发现BAX只在经过BH3类似物处理后存活的WT细胞中下降。BAX减少的可能原因是自噬的参与，ATF4已被证实可诱导自噬。结果一致的是，在ATF4或HRI缺陷细胞没有发现自噬p62/SQSTM1的降解（图7 G）。
PS的持久表型特征之一是对GPX4的依赖性，而ATF4和HRI缺陷细胞降低了对GPX4的依赖性（图7 H-I），这和脂质过氧化、CHAC1、GCLC的变化一致。接下来，作者在体内测试了ATF4和HRI缺陷细胞及其BH3类似物治疗后存活细胞的转移能力。WT PS细胞转移能力增加（图1G），在ATF4（图7 J）或HRI缺陷（图7 K）细胞中，转移能力基本消失。
最后，作者对BH3类似物处理后WT细胞中的DEGs进行了严格的比较分析，剔除在ATF4或BAX和BAK沉默细胞中的DEGs（图7 L），揭示了与炎症信号转导、免疫逃避、代谢、迁移和侵袭有关的几个靶基因（图7 M）。作者认为该基因集代表了一种“凋亡持续特征”。
为了测试其临床相关性，作者对已发表的肺腺癌（LUAD）样本scRNA-seq数据进行了基因集富集分析。值得注意的是，在RD（残留病）患者的样本中，上调或下调凋亡持续基因的基因集模块得分明显高于未治疗（TN）或疾病进展的患者（图7 N）。此外，与TN相比，RD中反应组HRI基因集分数增加，而KEGG GSH代谢基因分数显著降低（图7 O）。
HRI是PC9 LUAD细胞中翻译重编程和持久表型生成的相关激酶，HRI的表达与病理样本有关。肺癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌的病理样本显示，与正常组织对应部分相比，HRI的表达要强得多。HRI的表达也与患者生存率相关。HRI高（1/4位）和HRI低（4/4位）肿瘤患者的无病生存期和总生存期。与HRI值低的肿瘤患者相比，许多HRI值高的肿瘤患者生存率下降，风险比（HRs）显著增加（图7 P）。
图7 细胞色素c-HRI-ATF4通路驱动持久性表型
文章小结
综上所述，Douglas R.Green团队揭示了亚致死情况下细胞色素c促进癌细胞存活的新功能：
当癌细胞受到促凋亡药物的作用时，细胞启动凋亡反应，线粒体外膜通透改变，细胞色素c被释放到细胞质中，与血红素调节抑制剂（HRI）直接结合并激活综合应激反应（ISR）与ATF4的合成，启动翻译重编程，进而将细胞从死亡状态转变为存活状态（图 8）。
除此之外，团队还首次报道了PS持久性表型具有迁移能力增加的特征。
该研究解释了癌细胞耐药性产生的机制，同时揭示了细胞色素c-HRI-ATF4轴在其中的关键作用，为预防肿瘤耐药性产生以及癌症复发的药物研发提供了潜在靶点和思路，意义重大！
图8 研究模式图
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