肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，深入分析HCC微环境中免疫抑制的潜在机制对于开发新型治疗方式至关重要。库普弗细胞（KCs）作为肝脏微环境中的主要吞噬细胞，负责清除门静脉循环中的颗粒物质，既往研究表明在HCC中KCs存在M1和M2等异质性极化类型，其中M1型KCs通过消除肿瘤细胞来抑制早期HCC发生，并且KCs的极化参与募集CD8 T细胞在肝内浸润的过程。
通过将AKT（myr-AKT）和NRas（NRas-V12）等质粒通过高动力尾静脉转染到小鼠肝脏细胞中能够进一步模拟HCC表型。而巨噬细胞的M2型转化同样需要AKT激活。在这项研究中，作者利用AKT/Ras诱导小鼠HCC模型来研究KCs对免疫稳态和HCC的影响，同时探究miRNA如何通过调节免疫微环境影响HCC进展。
美国明尼苏达大学Guisheng Song研究团队发表在Gut的研究“MicroRNA-206 promotes the recruitment of CD8 T cells by driving M1 polarisation of Kupffer cells”发现MicroRNA-206能够通过KLF4-NFKB通路促进KCs的M1型极化，同时能够通过KLF4-CCL2/CCR2轴促进CD8 T细胞肝内浸润，从而抑制HCC进展。
1. AKT/Ras信号通路的激活抑制KCs的M1型极化
AKT/Ras信号通路在肝细胞中的异常激活被认为是AKT/Ras小鼠模型进展为HCC的关键因素，而目前关于KCs中AKT/Ras信号对HCC进展的影响尚不清楚。q-PCR、免疫荧光染色和流式细胞分析等多种实验发现：AKT/Ras小鼠KCs中M2型标记物表达显著增高，而M1型标记物表达显著降低。
2.KCs特异性表达的miR-206缓解AKT/Ras小鼠模型中HCC进展，同时促进KCs的M1极化
MicroRNA表达谱结果显示：miR-206在AKT/Ras小鼠模型HCC肿瘤中显著下调，并且有研究表明miR-206在人和小鼠HCC肿瘤样本中的表达水平均显著降低。作者意外通过AKT/Ras小鼠HCC模型发现：miR-206降低主要是由于KCs的miR-206表达下降。为进一步研究miR-206在AKT/Ras小鼠KCs中的作用，作者利用前期课题组已建立的小鼠模型：流体动力学注射pT3-CD68p-miR-206上调AKT/Ras小鼠肝脏KCs的miR-206表达模型，以及在AKT/Ras小鼠模型进展为HCC后注射MC-CD68p-miR-206的治疗模型。在两种模型中，与对照组小鼠相比，上调miR-206的表达能够显著抑制HCC肿瘤进展，进而提高实验组小鼠生存率。
免疫荧光染色和流式细胞分析显示：在AKT/Ras/miR-206小鼠肝脏中，M1型KCs显著增加，而M2型KCs显著减少，这点在人和小鼠的肿瘤细胞系中也得到进一步验证。由于在AKT/Ras/miR-206小鼠中未发现HCC，为进一步排除AKT/Ras/miR-206小鼠中KCs的M2-M1转换是由于缺乏肿瘤，而不是miR-206对KCs的M1型极化激活的作用，作者又进一步分析治疗模型中的M1/M2-KCs，结果证实KC特异性表达的miR-206能够显著促进AKT/Ras小鼠KCs中M2-M1转换。
3. miR-206通过抑制KLF4，激活NF-κB通路导致KCs的M2-M1极化转换
既往研究表明miRNA能够抑制靶基因表达，而miR-206在KCs中上调Ccl2表达，因此作者推测miR-206可能通过双重抑制机制促进KCs中Ccl2表达。结合单细胞测序数据库，作者进一步发现miR-206在KCs中特异性表达的7个潜在靶基因，其中KLF4是唯一编码转录抑制因子的基因，同时能够通过抑制NF-κB通路活化而调节巨噬细胞的极化。
既往研究发现多个M1标记基因的启动区均包含NF-κB结合位点。因此作者进一步推测miR-206可能通过靶向KLF4-NF-κB轴而促进CCL2分泌，从而引起KCs的M1型极化。研究发现Klf4的3′UTR的miR-206结合位点在人类和小鼠之间是保守的，Klf4和Ccl2主要在KCs中表达，萤光素酶检测证实miR-206与小鼠和人类巨噬细胞中Klf4的3′UTR直接结合。既往研究证实KLF4能够增强p65的转录活性，作者进一步研究发现：过表达p65能促进RAW264.7细胞系中M1型标记物的表达，而抑制Klf4表达逆转了p65的促进作用。
作者利用基因编辑技术消除KLF4的3’UTR内的miR-206结合位点，显著降低miR-206抑制Klf4表达的能力。miR-206能够促进RAW264.7细胞和THP-1细胞的M1型极化，而消除miR-206结合位点能够显著抑制miR-206促进M1型极化作用，且KLF4/NF-κB轴在AKT/Ras小鼠的KCs中被抑制，在AKT/Ras/miR-206小鼠模型和治疗模型小鼠的KCs中得到恢复。上述结果表明miR-206能够通过激活KLF4/NF-κB信号轴，促进巨噬细胞M1型极化。
4. miR-206通过促进CCL2分泌促进CD8 T细胞肝脏浸润
既往研究发现M1型KCs是趋化CD8 T细胞的重要成分。作者发现在AKT/Ras小鼠模型肿瘤中CD8 T细胞和CTL（CD8 GrB ）浸润均显著减少。
KCs中特异性表达miR-206能够显著诱导M1型标记基因的表达，而相关细胞因子在AKT/Ras/miR-206小鼠血清中也显著升高。既往研究表明CCL2能够通过CCR2调节CD8 T细胞和Tregs，作者结合公共数据库信息推测CCL2-CCR2轴能够募集CD8 T细胞肝内浸润。免疫荧光染色显示：miR-206能够显著促进CD8 T细胞和CTL肝内浸润，而AKT/Ras/miR-206小鼠肝脏内KCs附近CD8 T淋巴细胞出现显著聚集。
5. miR-206通过CCL2/CCR2轴增强CD8 T细胞的扩增和迁移
作者将CD8 T细胞与miR-206培养的RAW264.7细胞进行体外共培养发现：miR-206能够促进CCL2的分泌和CD8 T细胞扩增，CD8 T细胞显著高表达CD69和CD154，同时miR-206通过促进巨噬细胞中CCL2的分泌而趋化CD8 T细胞迁移。
作者又进一步利用sgRNA干扰miR-206表达，抑制其在RAW264.7细胞中诱导CCL2分泌的能力，而miR-206表达下调能够显著抑制其促进CD8 T细胞扩增和迁移的能力，而应用CCL2中和抗体和CCR2拮抗剂也得到同样的结果。这些结果证明在miR-206预防和治疗模型小鼠中，CCL2表达水平与CD8 T细胞肝内浸润密度呈正相关。
作者通过系列小鼠动物模型发现在AKT/RAS诱导HCC模型中，miR-206能够通过KLF4/NF-κB信号轴调节KCs极化的新机制，以及通过KLF4-CCL2/CCR2轴调控CD8 T细胞肝内浸润。同时作者进一步提出miR-206能够打破肝脏免疫抑制的可能性，强调miRNAs在维持免疫稳态中的作用，证明miR-206作为一种抗HCC免疫治疗剂的潜在可能。
https://gut.bmj.com/content/71/8/1642.long
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