一、引物设计原则引物
引物与扩增效率、产物特异性十分相关，因此引物设计的一般原则为：
表1
二、选择和设计荧光定量PCR的引物
1、从文献中直接查找，经过BLAST验证引物特异性后直接使用：
（1）如何在文献中查找引物：
①打开pubMed或百度学术输入所查基因名称，翻看相关文献 ，选定文章内的引物(Forward/Reserve)打开NCBI;
②NCBI-BLAST验证：点击BLAST
图1
③打开Prime-BLAST
图2
④输入文献中查询到Forward/Reserve引物：设置参数，PCR产物长度80-200bp(70-150),引物Tm值50/55/60
图3
至少横跨一个外显子
图4
⑤点击Get primer，弹出新的窗口，出现所需要的引物对：
图5
（2）在NCBI上直接设计引物
①打开NCBI,以PTEN基因为例：搜索
图6
②选择所需基因：PTEN(homo sapiens)
图7
③点击Pick Primer
图8
④更改参数，点击Get Primer,，在新的窗口得到所查找的基因的引物，一般选择前面的引物对，也可以通过所得引物的PCR产物判断引物的好坏，一般PCR产物长度过长（>1000bp）扩增不出来。
图9
⑤同样地，得到的引物可以同(1)一样用Primer-BLAST验证引物特异性，得到引物均为同一个基因的特异性最好。
（2）Primer Premier 5设计引物
①在NCBI上查找目的基因的序列，仍以PTEN基因为例:查询FASTA序列或者CDS序列
图10
图11
复制CDS序列：
图12
②打开Primer Premier 5：选择file→NEW→DNA sequence
图13
②粘贴CDS序列，“As is ”→“ok”
图14
③点击“Primer”
图16
图17
④设置参数：选择PCR产物，设计引物对（pairs），更改PCR产物长度，选择自动设计或者手动设计引物，一般选择“automatic”，“Manual”需要更改更多高级参数。若选择手动设计，设置条件约严苛，可供选择的引物对就越少；更改图19，与引物对优化条件（引物设计原则）尽量一致
图18
图19
⑤选择软件自动设计：可出现许多可供选择的引物对，后期可根据所选择的引物依照“从文献查找的引物对”进行“BLAST”验证引物特异性：
图18点击“OK”后，弹出图20：
图20
再点击“OK ”：
图21
⑥一般来说，位于前面的引物往往比较好，得分越高越好。点击任意一个引物：
我们可以从引物对自身是否形成发卡结构、引物对形成二聚体等参数判断引物的好坏，当然存在“Found”的提示有时也可用，但前提是∆G的值越小越好。
图22
⑦导出引物对：点击“sense”/“anti-sense”→“Edit Primers”→“Ctrl V”复制即可 。若引物对的Tm值不相近，也可通过在3’删减“C/G”进行优化。最后得到引物对也可在NCBI中进行引物对“BLAST”再次验证。
注意：
NCBI中直接设计引物，可直接搜索目的基因名称，选择“Pick Primer”,设置相关参数即可，对于miRNA（长度较短或NCBI库中没有相关数据），我们可以从MiRbase库中搜索到其成熟序列，复制到图16进行引物设计。
本文作者是'旺旺仙贝'同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿： 旺旺仙贝
校对：煲仔饭
素材：Canva
参考资料：
https://images.app.goo.gl/6Rqpnu71DeNVWx4SA
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