增加的中性粒细胞外陷阱通过引发肿瘤炎症反应促进肝细胞癌的转移潜能

【研究背景】

炎症激活是宿主和癌细胞之间的一种相互作用，通常在癌症发展和转移过程中被触发。同时，抗炎药物通过不太明确的机制显示出一定的抗转移作用。中性粒细胞是最丰富的免疫细胞，在炎症反应中起着重要作用，但它们对转移的贡献仍有争议。据报道，肿瘤携带的中性粒细胞可能会在转移部位诱导抑制过程 。然而，更多的研究表明，转移前部位的中性粒细胞募集在转移起始中起着关键作用。

中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 是广泛释放的胞外网状结构，由活化的中性粒细胞释放的染色质支架上的胞质蛋白组成。它们最初被发现是在先天免疫防御过程中用于捕获和杀死入侵病原体的，随后发现其与各种病理状况密切相关，包括自身免疫反应、伤口愈合、器官损伤和无菌炎症。NETs 在癌症中的认识才刚刚出现，在一些小鼠模型中，NETs与转移之间存在联系，在某些肿瘤中也有NETs存在的证据。尽管如此，NETs 如何影响转移仍有待探索。

肝细胞癌 (HCC) 是癌症相关死亡的第二大原因。HCC 最常见的转移是转移到肝和肺 。肿瘤相关中性粒细胞的高浸润和中性粒细胞与淋巴细胞的比例（NLR）升高已在HCC观察到，这与不良预后相关。但对中性粒细胞，尤其是 NETs 在 HCC 转移中的具体作用知之甚少。因此，我们设计了这项研究来揭示 NETs 在 HCC 转移中的参与，并揭示 NETs 在转移级联反应中的作用机制。此外，我们研究了由 NETs 触发的炎症反应，以及结合破坏 NETs 和抗炎疗法对 HCC 转移的影响。

【技术路线】

【补充】

中性粒细胞杀菌主要通过两种方式：

一种是通过直接吞噬病原体的方式，这也是认识最早，较为经典的方式；

另一种是中性粒细胞坏死或者凋亡后会形成一种特殊的结构，称为NETs（neutrophil extracellular traps），它是中性粒细胞重要的杀菌利器。NETs 由核酸物质组成，不含任何其他细胞骨架蛋白 。核酸物质包括DNA 和颗粒蛋白。DNA 是NETs 的主体部分，构成一个骨架结构从而固定各种蛋白颗粒。颗粒蛋白则包含由弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、髓过氧化酶（myeloperoxidase, MPO）等蛋白组成的原发颗粒，由乳铁蛋白、明胶酶等蛋白组成的继发颗粒和三级颗粒。

NETs 的产生受到多种诱导因素的影响，从而造成NETs 生成量不同。ROS、IL-8、LPS、补体因子5a（C5a）、碳酸酐酶抑制剂（CaI）、葡聚糖（β-glucan, BG）、豆蔻酰佛波醇乙酯（ PMA）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GO）等多种物质都能显著激活PMNs，引发NETs 的形成   。

NETs 在炎症部位大量产生，并在局部提供高浓度的抗菌分子，捕获并杀死各种病原体，快速控制病菌在体内感染，起到免疫抗菌 。NETs 通过局部提供高浓度的抗菌蛋白来消灭多种病原体，既能捕杀革兰氏阳性菌（如A 组链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌）和革兰氏阴性菌（如沙门氏菌和志贺氏菌），也能捕杀真菌（如白色念珠菌）。

【研究方法】

模型的建立

HepG2:人肝癌细胞

L02：人正常肝细胞

MHCC97H：人高转移性肝癌细胞

Hepa1-6：小鼠肝癌细胞

LPS诱导的NET模型，该模型已被广泛使用。

腹腔内注射 LPS以诱导 C57BL/6 小鼠的全身炎症，注射 LPS 后 6 小时内处死小鼠，收集血清检测 MPO-DNA用于评估NETs形成。 

通过尾静脉或脾脏注射Hepa1-6细胞，通过计算被肿瘤替代的肝组织的百分比（肝替代区域，HRA）来评估实验性肝内转移负担。使用 H&E 染色在组织切片上直接计数肺转移病灶。

【研究结果】

【结论】

我们的研究表明，来自 HCC 患者，尤其是转移性 HCC 患者的中性粒细胞中 NET 形成增加。增加的 NET 不仅可以捕获 HCC 细胞，还进一步诱导细胞死亡抵抗和增强侵袭能力以触发其转移潜能，这被标记为通过 NET 内化到 HCC 细胞和激活 Toll 样受体 TLR4/9 引发的炎症反应-COX2 信号。值得注意的是，通过阻断 TLR4/9-COX2 信号来消除激发的炎症反应，消除了 NET 引起的转移潜能。直接破坏 NETs 的 DNase 1 与抗炎药物阿司匹林/HCQ 的组合有效地减少了小鼠模型中的 HCC 转移。基于研究得出的NETs 在 HCC 转移中的作用，它可以作为一种新的治疗转移策略。

优点：

通过患者样本分析、构建肝转移小鼠模型、体外细胞共培养等体内体外实验探明了中性粒细胞外陷阱促进肝转移的分子机制，为肝转移的治疗提供了新的思路。

不足：

无 小鼠生存状态数据，无法得知NETs导致的转移增加是否对其生存有明显的影响。

【参考文献】

Yang LY, Luo Q, Lu L, Zhu WW, Sun HT, Wei R, Lin ZF, Wang XY, Wang CQ, Lu M, Jia HL, Chen JH, Zhang JB, Qin LX. Increased neutrophil extracellular traps promote metastasis potential of hepatocellular carcinoma via provoking tumorous inflammatory response. J Hematol Oncol. 2020 Jan 6;13(1):3. doi: 10.1186/s13045-019-0836-0. PMID: 31907001; PMCID: PMC6945602.

“三只猫、一个暖炉、一杯水、一本书，时光在淅沥的雨声中慢下来。”——村上春树《猫》

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