摘要
LC3特点
实验要点
LC3A/B/C有细胞/组织类型分布特点
查询细胞/组织中各亚型的表达谱，选择合适靶标的抗体
LC3-I可转变为LC3-II
检测LC3-I和LC3-II使用LC3A，LC3B或者LC3A/B的抗体均可。
脂化、膜相关蛋白
超声确保充分裂解
小分子量蛋白
~15%分离胶，0.22um印记膜转膜
LC3-II可被溶酶体降解
加入工具药（如氯喹等），阻断降解
LC3-I/II的形成和降解是一个动态过程
瞬时LC3-II表达不能反映自噬程度，需配合使用工具药（如氯喹）分析自噬变化
正文
在进行自噬研究时，WB检测LC3-I和LC3-II几乎是必做的实验，那么，进行LC3检测时，需要注意哪些要点呢？请看下文
LC3: 从何处来？往何处去？
LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切，生成胞质 LC3-I。LC3-I通过Atg7 和 Atg3（分别对应 E1 和 E2 样酶）参与的泛素样反应，使磷脂酰乙醇胺 (PtdEth，PE) 偶联，生成脂质化形式的 LC3，也称作 LC3-II，它可以附着到自噬体(autophagosome)的膜上，是自噬体的结构蛋白。在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B移除后回收，位于内膜的LC3-II则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。
图1：自噬信号通路的调控，点击下载源文件
LC3A/B/C有种属细胞/组织分布特点
LC3/Atg8 被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切，生成胞质 LC3-I。LC3-I通过Atg7 和 Atg3（分别对应 E1 和 E2 样酶）参与的泛素样反应，使磷脂酰乙醇胺 (PtdEth，PE) 偶联，生成脂质化形式的 LC3，也称作 LC3-II，它可以附着到自噬体(autophagosome)的膜上，是自噬体的结构蛋白。在降解过程中，位于自噬溶酶体外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B移除后回收，位于内膜的LC3-II则与包裹的内容物一起，被溶酶体降解。
哺乳动物LC3蛋白的四个亚型（LC3A, LC3B,LC3B2和 LC3C），他们的表达因组织或细胞类型而异。如图2所示，在甲状腺（Thyroid，第一行）中，LC3B的表达水平并不高，检测LC3A更为合适。所以，需要根据自己使用的细胞系或者组织的情况，使用合适的靶标抗体。当然，通过使用抗LC3A/B抗体，同时检测LC3A和LC3B，可以大大增加实验的成功率。
图2：小鼠组织/部分细胞中LC3A和LC3B的mRNA水平差异（来源： Biogps）
LC3 的来去是一个动态过程
正如前言所述，LC3-I和II存在一个生成-降解的动态过程。自噬小体有一个生成、融合、降解的过程，即“自噬流”。所以，单时间点LC3-II的表达改变并不能体现自噬的改变，需要使用一些阻断溶酶体降解的药物（如氯喹、巴佛洛霉素A1等），判断在干预手段下，细胞的自噬程度的改变。氯喹可以通过抑制溶酶体功能（比如升高它的pH值），抑制LC3-II的降解；巴佛洛霉素A1则是一种强效V-ATPase抑制剂，阻断溶酶体依赖的降解。在“堵漏”的前提下，根据一段时间内LC3-II的积聚程度，判断自噬的改变（图3）。
图3：干预条件下，LC3印记结果示例（摘自文献3）
a组，LC3-II在a处理下表达升高，使用Baf A1后，进一步升高，提示自噬流的升高；
b组，LC3-II在b处理下表达无明显变化，且使用Baf A1后无明显积聚，提示自噬流的降低；
c组，LC3-II在c处理下表达升高，使用Baf A1后未见明显积聚，提示自噬被抑制。
LC3 检测的注意点
目前的LC3抗体所检测的抗原表位都位于LC3的N端，由于PE基团结合可能导致N端区域的构象变化，使得抗体对LC3-II的亲和性更高，所以LC3-II条带显色深并不能代表该样本处于高自噬状态。另外，LC3-I对反复冻融更为敏感，也更易在SDS上样缓冲液中降解。基于以上两个原因，在半定量时，除了使用LC3-II/LC3-I的比值外，也有科学家使用LC3-II与管家蛋白（Housekeeping Protein）的比值进行半定量。
LC3 是一个膜相关蛋白
作为脂化和膜相关蛋白，在细胞裂解后，对其进行冰上短暂超声，促进蛋白的溶解，将LC3从膜上解离。
超声方法：使用35%-40%的最大功率进行3次超声脉冲，每次超声时间10秒,每次超声之间停顿10秒，不同的仪器可以调整最大功率水平在200W左右。
如没有细胞超声仪，可使用1mL注射器（带针头），通过反复抽吸的方式达到类似于超声的效果。
LC3-I 和LC3-II 是小分子蛋白
LC3-I的分子量约16KD，由于LC3-II接合了PE基团，所以理论上，LC3-II的分子量比LC3-I更高。但是，由于带负电的PE改变了LC-II的性质，使其疏水性更强，导致其在电泳中迁移率更高，所以，LC3-II在电泳后，停留在了更小分子量（约14KD）处。
小分子量、LC3-I与LC3-II仅有2KD差异，在WB中需注意：
· 使用高浓度分离胶（~15%，确认Tris缓冲液的pH值）进行分离；
· 转膜时，使用小孔径0.22um转印膜，湿转70V 1.5h即可。对于半干转（如 Trans-Blot Turbo System），则可使用2.5A 7min。
2018年10月，CST技术人员现场检测LC3，得到实验结果如下图所示，LC3-I和LC3-II条带清晰。
图4：使用经过氯喹（CQ）处理的Hela细胞蛋白裂解物（LC3 Control Cell Extracts #11972，为阳性对照），LC3A/B抗体(12741#)进行检测
自噬是一个“流动”的过程，目前，检测自噬流的方法有很多，除了Western blot外，还有电镜、长寿命蛋白降解实验，mRFP-GFP-LC3双荧光系统等等，每一种实验方法都有其优缺点，所以，需根据实验目的选择合适的实验方法，或者使用多个独立的实验方法进行交叉论证，才能得到可靠的结论。
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