单克隆抗体（简称单抗）可诱导非治疗相关的复杂免疫反应，除了抗药抗体（ADA）形成的体液免疫应答之外，免疫细胞活化或抑制都可能产生潜在的免疫毒性。随着单抗，尤其是具有免疫调节作用的单抗在肿瘤和自身免疫疾病领域的广泛应用，在药物进入临床试验前评价免疫毒性变得越来越重要。本文总结了单克隆抗体非临床免疫毒性研究与评价的考虑要点。
为了最大限度识别潜在的免疫毒性风险，应在临床前基于药物的结构特点、药理作用、免疫学效应、拟定适应症、给药方案，设计并进行免疫毒性的研究评价。单抗的非临床免疫毒性评价通常包括以下层级内容：（1）在分子结构基于常识或者生物信息学进行评估，该评估一般在药物分子初期的结构设计和筛选时进行，评估内容包括脱靶作用、免疫原性以及Fc效应；（2）采用人或动物细胞、组织进行体外或离体研究以评估靶向和脱靶结合、Fc效应和免疫原性潜能；（3）在药理学相关动物种属中进行体内研究。
一
体外免疫毒性研究
1.1 靶向/非靶向作用
单抗与免疫靶点的亲合力和免疫药理学活性可通过体外/离体试验来评价，评价内容包括免疫细胞抑制/激活、消耗或者细胞因子的产生。在临床相关的细胞试验中，应获得完整的免疫效应剂量反应曲线。在评估免疫药效的同时应考虑评估潜在的非预期免疫效应，如验证具有拮抗作用的单抗没有激动性，或验证具有受体阻断单抗是否会造成免疫细胞消耗。应考虑同时进行人和动物细胞的体外试验，并进行比较，以了解人体相关的免疫药理学是否能在毒理试验所用动物种属（食蟹猴或者啮齿动物）中表现出来，判断是否有些人体的潜在免疫毒性无法通过试验动物预测，判断是否需要通过人源细胞进行体外试验或早期临床试验进行评估。
1.2 Fc效应
单抗的Fc段可通过与FcγRs结合介导细胞因子释放等不良免疫反应。临床前应通过体外试验对Fc效应进行检测，首先可在无细胞系统中使用BIAcore检测Fc段与重组人FcγRs（如活化FcγRIIIA和FcγRIIA以及抑制性FcγRIIB）的亲合力，后续通常需在细胞水平进一步验证。对于ADCC和ADCP细胞试验，靶细胞选择取决于靶抗原的表达，可采用转染过表达靶抗原的细胞系。对于ADCC测定，免疫效应细胞通常采用经白介素（IL）-2活化后高水平表达FcγRIIIA的原代人NK细胞或NK细胞系。T细胞系经修饰以表达FcγRIIIA并转入报告基因结构，也可用于评估效应子活化程度。ADCP可以在全血或外周血单核细胞培养物中通过流式细胞方法进行评估，可以对细胞群进行定量。CDC可以通过免疫检测直接评估Fc段与补体C1q 的结合能力，使用固定相固定的IgG来捕获C1q并用荧光标记的抗C1q抗体进行检测。更常见的是，将表达靶抗原的细胞系或原代细胞与不同浓度的人补体和单抗受试物一起孵育，之后使用与ADCC试验类似的检测方式进行细胞毒性检测。
1.3 细胞因子释放试验
细胞因子释放综合征是免疫激发类单抗常见的免疫毒性反应。EMA 发布的指导原则建议不能过于依赖临床前动物体内试验，啮齿类和非人灵长类动物可能不会表现CRS，完整的安全性评价需要整合所有可用的体内和体外试验数据。细胞因子释放试验方法的选择应基于细胞因子释放机制进行，应根据靶向/非靶向、Fc效应功能对可能的作用机制进行预测。如果FcγRs结合是可能的机制，那么应在包含表达FcγRs的细胞（如中性粒细胞和血小板）的全血细胞中进行试验，试验中应加入补体。如果直接靶向T细胞的单抗或者靶聚集可能参与细胞因子释放，应采用外周血单核细胞进行试验。如果靶抗原仅在疾病状态（如在肿瘤细胞或活化的效应细胞或自发致病性细胞上）表达或者如果细胞因子释放机制涉及在全血或者外周血单核细胞中不存在的细胞类型之间的协作，那么诸如肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞或在活化时过度表达靶标的细胞系或原代细胞可以包含在检测系统中。除了试验系统的考虑，细胞因子释放的动力学是试验分析的重要关注点，有助于减少由于在错误的时间窗进行分析而导致假阴性的风险。药物研究中应伴有对阳性对照的分析，阳性对照应与受试单抗细胞因子释放的预期机制类似。细胞因子的检测项目应与受试药临床安全性考虑密切相关，无论采用哪种方法，一般来说IL-2、IL-8、IL-6、IFN-γ和TNF-α是基本的观察指标。
1.4免疫原性
抗药抗体（ADA）对临床的影响主要是降低药效，但有时也会造成严重的免疫毒性反应。在动物试验中除了关注ADA的生成，还要关注ADA相关的免疫毒性。由于多数人源化抗体对于动物种属是外源蛋白，动物体内免疫原性结果对于人体免疫原性的预测性较差。因此，在抗体的早期研发中可考虑采用生物信息学方法或者人源细胞对单抗的免疫原性进行预测。
二
体内免疫毒性研究
目前我国没有发布免疫毒性相关指导原则。国际上，FDA、 ICH 分别在2002年和2005年发布了免疫毒性指导原则。另外，ICH S6、ICH M3指导原则也对免疫毒性进行了较少篇幅的提及。我国主要参考ICH S8指导原则。尽管ICH S8和FDA免疫毒性指导原则将生物制品排除在外，但许多原则和策略也同样适用于单抗。ICH S8指导原则建议在一般毒性试验中观察免疫终点。不管单抗是否具有免疫调节作用，所有单抗的免疫毒性均应在一般毒性试验中评估。评价内容包括：血液学白细胞分类计数（包括巨噬细胞）、临床化学（球蛋白和白蛋白∶球蛋白比值），器官质量（胸腺、脾脏、淋巴结）和组织病理学（淋巴器官和组织）。在有免疫毒性担优、需要追加试验时，进行追加验证试验，如免疫功能试验或宿主防御试验。这些追加试验的考虑因素包括：一般毒性试验结果，药物的药理作用，用药人群，与已知免疫调节剂结果的相似性，药物在免疫器官的分布，临床已知结果。由于单抗半衰期长，应观察停药后是否能恢复到正常，是否存在长期不可逆转的免疫毒性作用，因此应设置充分的恢复期来观察药物清除后的毒性反应。
对于免疫调节类单抗，除了验证对药理靶点的影响外，还需验证是否对其他免疫系统也具有影响，或者免疫影响的维持时间是否超出了治疗的需求。需要在确认药理作用（如B细胞去除或者T细胞激活）的同时，识别与药理作用相关的或者非靶向、非预期的免疫毒性。免疫组织有改变时，应考虑进行免疫表型分析。对于特异结合免疫细胞或者具有很强Fc效应的单抗应检测血清细胞因子，也应考虑检测急性期蛋白、补体、凝血因子、离体淋巴细胞因子激活、离体T细胞的增殖。心电图评估可与细胞因子释放取样同步进行，以评估细胞因子水平升高是否引起心血管方面的改变。对于靶向免疫系统的单抗，即使在预试验中没有免疫状态的改变，可考虑在相关种属中进行的4周或13周一般毒性试验中设置卫星组观察对免疫功能的影响，或者追加单独的研究观察对免疫功能的影响，推荐的观察终点为T细胞依赖性（TDAR）。如果在4周和13周试验中观察到免疫抑制，在26周试验中应注意组织病理学观察淋巴增生疾病或者肿瘤风险。单抗除了免疫抑制或免疫激发外，还可能引起自身免疫疾病或者过敏反应。自身免疫性疾病发病率低，依赖于病人疾病状态、遗传、种族、年龄、环境因素、免疫状况等，这是在动物模型很难复制的。目前尚没有经过验证的自身免疫性疾病动物模型和过敏性动物模型，但可以考虑采用动物模型进行2个抗体的比较研究。
三
结果评价
免疫毒性试验结果的评价应包括毒性反应的特征、严重程度、频率、剂量相关性和可恢复性。通常，对于某些潜在的免疫毒性在追加非临床试验验证的同时，更应考虑在临床研究中进行控制。免疫药理、免疫毒性数据有助于研究者了解什么免疫药理作用是治疗需要的，什么风险属于免疫毒性，进而有助于制定受试者纳入标准，指导联合用药。对于免疫激发类单抗，由于毒性反应主要来自于免疫毒性，靶向免疫药理反应、免疫毒性如细胞因子释放等试验数据对于首次临床起始剂量的拟定非常重要。此类单抗新药通常基于最低预期生物效应水平（MABLE）进行临床起始剂量的拟定，将拟定的起始剂量与毒性反应剂量，如细胞因子释放剂量相比，评估起始剂量的安全风险。
四
结语
大多数单抗可诱导免疫反应，非药理所需的免疫反应可对机体造成免疫毒性。产生抗药抗体的免疫原性可能影响药物的疗效，也有可能产生免疫毒性。对于免疫调节类单抗，免疫反应是药理作用，免疫毒性是主要的毒性反应。通常应在临床前，基于药物作用特征，对药物的免疫毒性进行逐步分层研究，需要追加试验时，应进行追加研究。同时，应注意体内外研究相结合，动物种属和人离体细胞相结合，多途径进行研究。
（药理毒理学部肿瘤适应症小组供稿）
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