植物 circRNA 系列|文献阅读 4|拟南芥叶片发育过程中circRNA的鉴定

本篇为植物 circRNA 系列文献阅读第四篇，模式植物拟南芥 circRNA 数据型文章第二篇。今天分享的文章题目为：Identifying andCharacterizing the Circular RNAs during the Lifespan ofArabidopsis Leaves，文章链接为 https://doi.org/10.3389/fpls.2017.01278

背景

1.      叶子作为主要的固碳器官能够将能量转化储存。不同的发育阶段其具有不同的生理形态及功能。在生长阶段，叶片利用光合作用积累化学能和营养；而在衰老阶段，叶细胞在代谢和细胞结构上显着变化，而这个过程受到了多层复杂的调节。

2.      已有报道显示，植物circRNA与动物circRNA的特征存在诸多差异，植物circRNA的生物合成及功能研究尚不清晰，因此本文围绕叶片周期过程中circRNA为研究内容展开，并借以RT-PCR实验验证，旨在探索调控叶片生理过程的circRNA.

主要材料与方法

1.       材料

a.      数据来源

拟南芥参考基因组下载于Ensembl Plants数据库；circRNA数据来源于拟南芥叶片RNA-seq数据(GEO accession GSE43616; read length 101 bp)

b.      实验材料

野生型，常光照（16：8）；4,16,28days，光照4小时下收集轮座叶片（rosette），通过RT-PCR验证circRNA的差异表达。

2.       分析流程

a.      circRNA的鉴定使用MapSplice 2.0，并获得序列数据。

b.      表达水平采用Log2(fold-changes)计算，分为两个生长阶段进行4days for G- to -M stage (the growth -to -maturation stage, 4–18 days) and 16days for M- to -S stage (the maturation -to -senescence stage,16–30 days)差异分析，差异表达分析阈值采用absolutelog2 (fold-changes) ≥2。

c.      miRNA靶预测通过3个预测软件得到：（1）psRNAtarget（2）TAPIR（3）AtmiRNET 并根据表达量变化选择相关miRNA (Spearman’s correlationcoefficient ≤–0.5). 并由Cytoscape (version 3.4.0)构建circRNA–miRNA–mRNA互作网路图。

d.      功能注释包括GO及KEGG使用DAVID (version 6.8).

 主要结果

1.       circRNA的鉴定及特征描述

处理GSE43616数据后，最终获得168个circRNA，对比PlantcircBase数据库记录40个新鉴定的circRNA未被记录，以其来源为依据的分类结果如表一。其中，包含3条来源于叶绿体基因组基因间隔区域，但未发现来源于线粒体基因组的circRNA。并具有以下特征：同一个基因通过可变反向剪切得到多个不同的circRNA； circRNA表达具有时空特异性，在两个阶段表达的circRNA为42个。

 

2.       差异表达及验证

4倍阈值条件下，在G-to-M阶段中5个circRNA上调，1个下调；而M- to –S阶段，34个上调，1个下调；在两个阶段3条circRNA均表达差异。从中规律显示，上调的circRNA可能在叶片衰老过程中起到关键作用。随后作者选取了4个高表达的circRNA进行验证，均符合数据分析的表达趋势。(Figure 2)

3.      上调的circRNA对来源基因表达影响

作者调查了有明显变化的circRNA与其来源基因转录本之间关系，两个阶段仅在M-to-S阶段中，9/34上调circRNA来源基因的线性RNA表达同时增加，暗示circRNA丰度变化在一定程度上与宿主基因的一般转录无关，得到以下结论：叶片衰老过程中circRNA的上调不是相应宿主基因上调转录本的结果，且在衰老过程中起重要作用。

4.       circRNA–miRNA–mRNA调控网络的构建

作者基于前人研究的差异表达的转录本和miRNA结果，使用三个预测软件预测其互作的差异表达circRNA，通过相关性筛选分别在G- to –M和M- to –S两个阶段获得到20和220对互作关系并构建网络(Figure 3)，能够说明在衰老阶段circRNA表达更活跃。

 

5.       circRNA的功能注释

M- to –S阶段的GO注释显示，除了生物合成过程的调节及细胞代谢，还包含激素响应、渗透压响应及有机物响应；并预测获得了一系列调控通路，同样M- to –S阶段的预测情况较为复杂，涉及多个关键基因的调控例如ACD1，JAZ1等，在卟啉、茉莉酸等代谢过程中发挥功能，说明circRNA参与叶衰老过程 (Figure 5)。

 

 小结

作者通过重新分析已发表的转录组数据，获得一批叶发育过程中的circRNA并重点聚焦在叶衰老过程。通过差异表达筛选到一批在衰老过程中发挥功能的circRNA，结合功能注释，拟解释叶衰老过程中circRNA起到的关键作用。定量验证实验选取的差异表达明显的4条序列检验三个时间节点的表达量，但是并没有更加深入的分析。从全文看，作者初步探索了叶衰老相关的circRNA，并预测了circRNA可能参与的调控途径，由于数据来源于公共数据库，本文是一篇低经济成本的circRNA数据型文章。

 

转自生信草堂公众号，已授权

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