【综述】生物钟基因与心血管疾病的研究进展

本文刊于：中华心血管病杂志, 2020,48(07): 610-615

作者：杨瑾 徐志峰 苏嘉 范淑芳 王嘉羽 季林丹 陈晓敏

单位：宁波大学医学院 宁波市镇海区人民医院 宁波市第一医院 

摘要

心血管疾病严重威胁着我国居民的健康。生物钟在心血管系统的生理过程中起着重要的调节作用，包括调节血压、心脏收缩和心率等。在环境周期信号的作用下，生物钟基因及其编码的蛋白质组成转录-翻译反馈环路，通过神经传导和体液途径实现信号输出，从而调节生物体的生理、生化和行为的昼夜节律。心血管疾病的发病时间具有昼夜变化的特点，一些生物钟基因表达的改变促进了心血管疾病的进展。该文介绍了心血管系统的昼夜节律，整理总结了高血压、动脉粥样硬化与心肌梗死等疾病中的相关生物钟基因及其分子机制。对昼夜节律和生物钟的研究为心血管疾病的预防和治疗提供了新思路。

近年我国经济迅速发展，居民生活方式发生转变，人口老龄化加速，心血管疾病的患病率逐年递增。《中国心血管病报告2018》报道我国心血管疾病死亡率也呈上升趋势，且位居各疾病首位^［1］。此外，冠心病、高血压等心血管疾病也呈现出年轻化的趋势，心血管疾病严重威胁着我国居民的健康。以往研究认为血脂异常、肥胖、糖尿病、酗酒和吸烟等是心血管疾病的高危因素，并据此制定了相关的防治策略。最近有研究提出维持昼夜节律的生物钟与上述心血管疾病的发生、发展、预防和治疗紧密相关。具体而言，心血管疾病的发病时间具有昼夜变化的特点，一些生物钟基因表达的改变参与了心血管疾病的病理生理过程。研究表明生物钟不仅主导了心血管生理学和病理生理学变化的节律，而且可能是疾病预防和治疗的重要靶点。因此，深入探讨心血管疾病与生物钟的关系可为心血管疾病的防治提供新的思路。

一、生物钟与心血管系统

由于地球的自转与公转，光照、温度、湿度等均会发生周期性变化，自然界大多数的生命活动也呈现出与此一致的生物节律，包括昼夜节律、月节律和年节律。其中，昼夜节律内在的运行机制称为昼夜时钟，即生物钟^［2］。在哺乳动物中，生物钟在解剖水平由中枢生物钟与无数的外周生物钟组成。中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）内，是生物节律的起搏器，而外周生物钟位于外周器官和组织。中枢生物钟通过视网膜光信号与环境同步，经神经、体液信号整合所有的外周生物钟，并通过定期重置来保证生物体与环境之间、不同器官外周生物钟之间的同步性。生物钟基因，指能够使生物体产生昼夜节律，并控制其运转的基因，是生物钟的分子基础^［3］，可分为核心钟基因和钟控基因（clock controlled genes，CCG）。核心钟基因主要有Clock、Bmal1、Per1/2/3和Cry1/2，钟控基因主要有Clock的同源类似物Npas2、Rev-erbα、Hlf、Dbp、Tef、E4bp4、Stral3/Dec1、Rorα和Ck1ɛ等。在转录水平上，生物钟蛋白可作为转录因子，通过E-box、D-box和RORE等顺式作用元件直接控制钟控基因的表达；可分为正性调控因子（如BMAL1、CLOCK）和负性调控因子（如PER、CRY）。生物钟基因及其编码的蛋白质通过一个自动的转录-翻译反馈环路实现24 h昼夜节律的调控作用^［3］，蛋白CLOCK和BMAL1在细胞核内形成异二聚体CLOCK/BMAL1，激活目标基因Per、Cry和Rev-erb的转录。PER和CRY蛋白聚集在细胞质中形成异二聚体，并转移到细胞核中。当PER/CRY与CLOCK/BMAL1结合时，复合物与DNA分离，从而终止下游基因的转录。同时，REV-ERB的积累也抑制了Clock和Bmal1的转录。随着PER、CRY和REV-ERB蛋白水平的降低，将开始新一轮的转录激活。其中，核心钟基因、钟控基因及其编码的蛋白质通过转录-翻译事件相互衔接，组成生物钟周期振荡的自身调控反馈环路，从而调节生物体的生理、生化和行为的昼夜节律。昼夜节律紊乱行为如轮班工作、穿越时区等将增加患病风险，包括高血压、冠心病等心血管疾病^［4］。

心血管系统的生理指标和电生理特性表现出明显的昼夜节律。如心率、心肌收缩力、血压在清晨上升，午后达到峰值，夜间最低；夜间房室结传导、希氏-浦肯野纤维传导和心室复极减慢，P-R间期、R-R间期、QRS波和Q-T间期延长^［5］。一些心血管疾病的发生也具有昼夜节律。如急性心肌梗死与肺栓塞、致命性的心室颤动（室颤）大多发生在清晨^［6］。以往被认为是神经体液因素所致，而现在研究认为是生物钟起了主要作用。其中中枢生物钟可直接影响心血管的功能。其通过自主神经功能、血儿茶酚胺浓度的昼夜变化等神经体液因素直接调控心脏钟控基因，对心率、心肌收缩力等进行调控。另一方面，中枢生物钟也可通过统筹血管生物钟和心脏生物钟间接调控钟控基因来控制细胞功能并实现心血管生理及病理生理过程的昼夜变化。

血管的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞都存在核心钟基因的周期性表达。内皮细胞产生的氧化还原活性物质是参与血管平滑肌细胞松弛和收缩的关键信号分子。内皮依赖性舒张由3‌种主要血管扩张剂介导：内皮衍生舒张因子——一氧化氮（nitric oxide，NO），内皮衍生超极化因子——过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）和环氧二十碳三烯酸，以及前列环素。其中NO、H₂O₂的生成分别需要内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases，Nox）的参与。生物钟通过对eNOS、Nox表达的调节来控制NO、H₂O₂生成的昼夜变化，并最终调控血管24 h的舒缩节律^［7］（图1A）。同时，生物钟基因参与内皮细胞环氧合酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）的表达，调控其衍生的内皮衍生收缩因子的生成，包括前列腺素（prostaglandin，PG）和血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）。虽然暂未发现COX-1的昼夜节律性，但Per参与了COX-1的表达是明确的。平滑肌细胞中，参与α1-肾上腺素受体激活血管收缩的蛋白（Rho依赖性激酶-1/2和蛋白激酶C加强的磷酸酶抑制剂-17）也表现出昼夜节律，这可能是交感神经诱导的血管收缩呈现昼夜变化的原因^［8］。生物钟参与了血管层细胞的血管张力调节，故血压的周期性波动与血管的节律性密切相关。

图1 生物钟基因与血压调控示意图（1A：生物钟通过参与内皮细胞中eNOS、Nox、COX-1的表达过程调控NO、H₂O₂、PG和TXA2的生成，并最终调控血管24 h的舒缩节律；1B：Bmal1通过调节Na⁺/K⁺-ATP酶β1亚基的昼夜表达影响血管功能；1C：生物钟基因Per1通过对NHE3、SGLT1、NCC、αENaC的正性调控调节肾脏Na⁺代谢）

心脏中也存在核心钟基因的周期性表达，这已在心肌细胞、心肌基质成纤维细胞和心脏祖细胞样细胞等多种细胞中发现^［6］。另一方面，已发现心脏中13%的编码蛋白基因的转录组表现出昼夜节律，可能为心脏钟控基因。心脏钟控基因的功能多种多样，目前已明确的有代谢、心肌收缩、电生理和信号传导等。代谢水平的通量分析表明，心脏生物钟在睡眠-活动的过渡阶段，预测到唤醒后能量需求增加，而促进氧化代谢，快速增加能量储存；在活动期，心脏葡萄糖的利用达到峰值，以满足增加的能量需求；在活动期将结束时，心脏糖原和甘油三酯的合成达到峰值，为后续的睡眠/禁食期储备能量；在睡眠阶段开始时增加蛋白质的周转供应，促进心肌的修复与更新^［9］。功能研究发现，破坏心脏生物钟基因后小鼠心率、心脏收缩力节律性波动减弱，而且小鼠发生了年龄相关的扩张型心肌病，寿命缩短^［10］。在电生理方面，心脏生物钟通过调控窦房结细胞中超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型4基因的表达控制I_f电流参与心脏起搏；通过控制K⁺电压门控通道H家族2‌型的昼夜表达参与心室复极；通过控制电压门控钠通道α亚基基因的表达参与心肌动作电位0期除极和传导，从而维持心肌细胞兴奋性和传导性^［5］。信号传导方面则体现在心肌细胞对肾上腺素、胰岛素和脂肪酸等刺激的反应性具有昼夜节律依赖^［2］。生物钟与上述钟控基因作用的具体机制在电生理方面较为明确，其他仍有待进一步研究。

二、生物钟与高血压

血压本身就具有生理性的昼夜节律，即血压模式。一般血压24 h波动呈现“双峰一谷”，第1峰为晨峰（上午8:00—9:00），第2峰在下午（下午6:00—8:00），谷在夜间（凌晨2:00—3:00）。夜间血压下降10%~20%为杓形模式，而下降<10%的为非杓形模式。杓形血压对心血管及其他脏器具有保护作用，而非杓形血压具有发生心血管并发症的风险。临床研究表明夜班人群具有更高的收缩压和舒张压^［11］，提示外部环境因素导致的昼夜节律紊乱可直接影响血压。然而，血压的内部调控较为复杂，由多种因素参与。现有研究表明生物钟基因可能主要通过参与调控肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin angiotensin aldosterone system，RAAS）、血管功能和肾脏钠离子代谢来影响血压。

RAAS的过度激活是高血压形成的原因之一，生物钟基因可能通过影响RAAS参与高血压的形成。自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）与正常大鼠的肾素、血管紧张素（angiotensin，Ang）Ⅰ、AngⅡ、醛固酮的昼夜节律不同。Tanaka等^［12］发现SHR有一个异常的肾上腺昼夜节律生物钟，相较于对照组，其肾上腺中转录激活因子Bmal1、转录抑制因子Per2、Cry1以及钟控基因Rev-erbα、Rev-ervb、Dbp的mRNA表达相位均提前约4 h，且Per1、Per2、Per3的峰值表达水平均偏低。肾上腺中受昼夜节律调控的代表性钟控基因是编码类固醇激素合成急性调节蛋白（steoidogenic actue regulatory protein，StAR），其表达谱以及血清中糖皮质激素、醛固酮浓度的昼夜节律也呈阶段性提前，表明钟控基因的转录调节影响了肾上腺中类固醇激素的分泌。另有实验观察到Cry-/-（Cry基因被彻底敲除）小鼠高血压模型的血中肾素、醛固酮昼夜分泌节律与对照组相反，且血中24 h醛固酮和肾素含量、日间皮质酮含量明显升高，提示生物钟蛋白CRY可能通过RAAS调控血压昼夜节律，维持血压正常^［13］。推测生物钟基因可能通过抑制肾素血管紧张素信号的作用最终影响肾上腺分泌醛固酮，而Cry-/-的盐敏感性高血压小鼠更容易伴发高醛固酮血症进一步证实了这一点^［14］。

生物钟基因也可通过影响血管功能参与高血压的形成。如前所述，生物钟对内皮细胞信号传导的关键通路具有重要影响。Bmal1的表达水平直接调节血压的昼夜节律，是血压调节的关键基因。有研究发现Bmal1-/-小鼠持续维持低血压状态，血压活动节律完全消失^［15］。这是由于Bmal1^-/-小鼠血管内皮细胞中Nox表达增加，NO信号解耦连使超氧化物增加，诱发血管内皮功能障碍所致。相反Per-/-小鼠的血管收缩明显增加，这是由于PG与TXA2升高所致^［7］（图1A）。同时，Bmal1通过调节Na⁺/K⁺-ATP酶的昼夜表达来影响血管功能。Na⁺/K⁺-ATP酶由α和β亚基组成，决定Na⁺跨膜梯度，维持细胞的跨膜电解质转运。Nakashima等^［16］发现小鼠CLOCK/BMAL1异二聚体和软骨分化表达基因1蛋白（differentiated embryo chondrocyte expressed gene 1，DEC1）通过CACGTG E-box分别增强和抑制了Atp1b1的转录，诱导Na⁺/K⁺-ATP酶β1 亚基表达的昼夜节律（图1B）。当Na⁺/K⁺-ATP酶功能降低时将导致细胞内Na⁺和Ca²⁺浓度增加，动脉壁平滑肌细胞收缩加强，肾上腺素能受体密度增加，血管反应性加强，最终发生动脉血压升高。

生物钟基因还可通过影响肾脏钠离子代谢参与高血压形成。Solocinski等^［17］发现Per1-/-小鼠因无法表达PER1而对高盐和盐皮质激素的敏感性增加，在安静期血压仍维持在高水平，导致了非杓形血压模式。该团队的相关研究提示PER1蛋白能够通过对肾脏近曲小管的Na⁺-H⁺交换器3 （Na⁺-H⁺exchanger3，NHE3）、Na⁺-葡萄糖协同转运蛋白1 （Na⁺-glucose cotransporter1，SGLT1），远曲小管中的Na⁺-Cl^-协同转运蛋白（Na⁺-Cl^-cotransporter，NCC）和集合管的上皮钠通道α亚基（α subunit of the epithelial sodium channel，αENaC）表达的正性调控来调节肾脏对Na⁺的处理^［18］（图1C）。以NCC为例，PER1可能通过与其他生物钟蛋白的共同作用，对NCC和无赖氨酸激酶（with-no-lysine kinases，WNK）1进行正调控，对抑制NCC的WNK4和抑制WNK1的肾脏特异性WNK1（kidney specific WNK1, KS-WNK1）进行负调控，协同调节NCC/WNK通路^［19］。这也是血压调控的重要机制，参与了非杓形高血压的形成。

三、生物钟与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是以脂质和炎症细胞沉积为特征的病变，主要累及大中型动脉血管壁，是心血管意外的重要病理生理过程。其中，脂质代谢与炎症过程均具有自身的活动节律性。人类的血脂浓度具有昼夜节律，血清总甘油三酯（triglyceride，TG）和甘油三酯载脂蛋白在日间升高，夜间降低^［20］。外部环境与内部生物钟基因的变化均会影响这种节律性。因此，轮班造成的外部环境变化使内在生物钟无法立即适应，从而影响血脂代谢。如，轮值夜班人员的餐后TG明显升高^［21］。另外，临床研究发现，生物钟基因CLOCK的rs4580704的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与低脂饮食具有基因-饮食相互作用，其主要等位基因携带者（C/C）配合低脂饮食能够明显改善与冠心病相关的炎症状态和血脂异常^［22］。因此，生物节律与动脉粥样硬化之间的关系受到了学界的关注。

生物钟基因可通过参与脂质平衡影响动脉粥样硬化。在动脉粥样硬化小鼠模型的心脏及主动脉中，与脂质代谢相关的钟控基因表达水平更低，且不具有节律性^［23］。血脂平衡是通过脂蛋白的产生和分解维持的，而载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）和微粒体甘油三酯转移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTTP）是脂蛋白的必需结构蛋白。有研究发现生物钟可能通过对MTTP基因的昼夜转录调控来控制小肠、肝脏中MTTP的表达，最后参与ApoB、TG的昼夜节律^［20］。另外，TG的昼夜节律与激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）的昼夜表达有关。小鼠实验中发现HSL在安静期被激活，在活动期失活，这是BMAL1/CLOCK通过E-box调控HSL的昼夜表达实现的^［24］。说明生物钟可通过调节HSL的活性调控TG的节律。上述结果均证实了生物钟参与调控脂质平衡，但基于生物钟基因分子水平的具体机制仍有待探索。通过小鼠实验已明确Bmal1、Clock在脂质代谢中发挥着关键作用。Bmal1-/-小鼠血脂异常、动脉粥样硬化的发生率明显升高，将Bmal1-/-小鼠的主动脉移植给野生型小鼠后也出现了严重的动脉粥样硬化，而过表达Bmal1则可减缓二者的发生和发展^［25］。此外，Clock也具有类似作用。ApoE-/-的动脉粥样硬化小鼠模型Clock表达水平升高，振荡幅度加大^［23］。CLOCK蛋白通过调节上游结合转录因子2的表达来调节巨噬细胞ATP结合盒蛋白家族A1的水平，从而维持低胆固醇水平，缓解小鼠动脉粥样硬化^［26］。

生物钟基因也可通过参与炎症过程影响动脉粥样硬化。Winter等^［27］观察到小鼠白细胞迁移到粥样硬化病变部位的粘附过程存在昼夜节律，天亮时达峰值，深夜达谷值，其受趋化因子CCL2调节，即CCL2有节奏的释放或阻断信号因子以调节白细胞的聚集粘附。当血管屏障被破坏时，白细胞迁移至血管壁趋势以及炎症反应进一步增强。动物实验证实小鼠内皮细胞Bmal1基因的缺失会导致趋化因子CXCL5、CCL20和CCL8表达增加，致使血管屏障功能和内皮细胞完整性受损，致白细胞迁移至内皮细胞层^［28］。此外，生物钟基因Cry1可能是炎症潜在影响因素。动脉粥样硬化小鼠过表达Cry1可减少促炎因子、粘附分子、炎症相关蛋白的表达，降低血中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平，最终减小粥样斑块面积。上述现象是Cry1通过调节核因子Toll样受体（TLR）/核因子-κB（NF-κB）通路抑制体内NF-κB的激活实现的^［29］。临床研究也发现动脉粥样硬化患者的CRY1水平明显降低^［30］，进一步支持动脉粥样硬化的发生可能与失去CRY1的保护作用有关。

四、生物钟与心肌梗死

心肌梗死指部分心肌的血液循环突然中断，心肌因无法得到足够血供而导致的损伤。冠状动脉粥样硬化是心肌梗死重要的病理生理学基础，不稳定的斑块导致血栓形成。心肌梗死好发于清晨，这与清晨血小板最活跃、纤溶酶原激活物抑制剂和聚集到受伤组织中的中性粒细胞最多有关^［31］。

有研究发现生物钟基因的SNP与心肌梗死的罹患风险相关。Škrlec等^［32］通过病例对照研究探讨了心肌梗死与4‌个昼夜节律基因（ARNTL、CLOCK、CRY2和PER2）SNP之间的关系，发现PER2的rs35333999 T等位基因、CRY2的rs2292912 G等位基因可显著增加心肌梗死易感性。但是生物钟基因的变异是否足以导致心肌梗死尚需进一步证实。有动物实验证实Per2-/-小鼠的心肌梗死范围更大是由于失去了PER2蛋白的保护作用^［33］，其可能机制为缺血期间Per2激活后更多地募集炎性细胞因子，来调节缺血期间的脂肪酸β氧化和再灌注期间的炎症反应。在心肌细胞生物钟突变型小鼠心脏中，脂肪分解明显减弱，这也是动脉粥样硬化患者进一步出现心肌梗死的原因^［34］。

环境因素导致的生物钟紊乱也降低了心脏对缺血的耐受性，从而促使心肌梗死的发生。流行病学调查发现，轮班工作和失眠显著增加了罹患心肌梗死的风险^［4］。持续人工照明或喂食增加了重症监护患者心肌梗死发病率和病死率^［35］。另外，心肌梗死的发病时间也影响疾病转归。心肌梗死发生在清晨所造成的损害和心功能障碍比下午更为严重^［36］，其具体的调控机制仍有待进一步研究。

五、生物钟与其他心血管疾病

生物钟在其他心血管疾病中也具有重要作用。如前所述，心脏生物钟通过参与心脏离子通道的表达调控电生理的昼夜节律。另有研究认为心脏生物钟可能通过转录因子Krüppel样因子15（Krüppel-like factor 15，Klf15）调控K⁺电压门控通道相互作用蛋白2的节律性表达，从而影响瞬时外向钾电流，使心脏复极波具有昼夜节律。当小鼠缺乏或过表达Klf15‌时，其心脏复极波失去昼夜节律性，易导致心律失常^［37］。REV-ERBα的小分子激动剂可减轻小鼠心肌肥厚并改善心功能^［10］。这是由于REV-ERBα可在心脏病理应激期协调转录抑制，阻碍基因程序的致病性切换，抑制心脏肥大基因的表达。对于主动脉缩窄或心肌病小鼠，中断正常明-暗周期会增加心功能障碍^［38］。对于缺血再灌注损伤的小鼠，心肌细胞的耐受性也具有时间依赖性^［39］。与觉醒-睡眠转变期发生心肌缺血比较，在睡眠-觉醒转变期发生心肌缺血再灌注1 d后心肌梗死面积大了3.5倍，且再灌注1‌个月后梗死面积进一步增大，心肌纤维化和不利重构也更为严重，同时心肌收缩功能受损也更为严重。这可能是心肌细胞生物钟通过蛋白激酶B、糖原合成酶激酶3β调控的，但具体机制仍有待探索。

因此，时间可能成为心血管疾病治疗的关键因素。以昼夜节律为出发点，结合药物及生活方式的联合干预有益于心血管疾病患者的治疗和改善预后，并有可能指导用药方案与手术时间的选择。如在睡前服用降压药物来控制夜间血压可明显降低心血管不良事件的发生率^［40］；下午进行主动脉瓣置换术的患者围手术期心肌损伤明显低于心肌REB-ERBα最高的早晨^［41］。所以，昼夜节律知识的转化很可能使心血管疾病患者受益。

综上所述，生物钟在生理学和临床医学中的重要性越来越受到关注。昼夜节律影响着心血管系统的正常生理和病理生理过程，与心血管相关疾病的发生、发展和结局息息相关。在当前快节奏的社会模式中，维持规律的日常生活变得非常困难，导致生物节律失调的环境因素如轮班、长时间工作等也往往导致心血管疾病的发生；相反，顺应昼夜节律的行为，如定时进食、规律作息则能够减少罹患相关心血管疾病的风险。换言之，节律相关基因与环境的交互作用影响着心血管疾病的发生，其确切的分子机制仍有待进一步探索。维持正常的昼夜节律可作为疾病预防战略，而研究生物钟在心血管疾病中的分子机制为改进临床治疗方案、寻找新靶点和预后标志物提供了新思路。

参考文献（略）