干货|如何铺出漂亮的细胞板？这样做就对了

细胞铺板大概是细胞实验中最常见又必须掌握的一门技术，看起来是非常简单的一项操作，但其实也不是那么好做的，有很多人不是很得要领，经常会遇到细胞中间密或者中间稀疏等「细胞分布不均匀」的情况。

如下图为：细胞铺板时，常出现的细胞分布不均匀现象。

（图片来源于网络）

要知道把用于实验的细胞铺的均匀且密度适宜，不仅看起来赏心悦目，更是决定了后续实验的成败（细胞聚集导致的接触抑制现象使实验数据的可信度大打折扣）。

小编也是历经多次失败后，才发现原来细胞铺板是有规律可循的，今天就和大家聊一聊：「细胞铺板」技巧。

个人认为铺板成功的关键在于对细胞消化和铺板方法的正确拿捏和掌握。即（1）细胞一定要消化好！！（2）铺板前要混匀！把可能的细胞团尽可能分开！！

细胞铺板实验

主要分为3大步骤：收集细胞→细胞计数→细胞铺板。

一、收集细胞，制作单细胞悬液

贴壁细胞需要将细胞消化收集，消化后的细胞一定要充分混匀，要把聚在一起的细胞团充分地吹打开，最好是单个的状态，但同时又不能损伤细胞。

这里需注意：

• 消化细胞需要选择适用的消化液、适当的消化温度和时间。建议新手或者养的是一个新细胞时，自己要观察最佳胰酶消化时间及浓度。

• 消化后需要轻轻拍打细胞贴壁面，震落细胞。

• 一般用1000rpm/min离心即可，离心力太大细胞容易抱团！

• 离心后，要充分悬浮！悬浮离心后的细胞团时，先不要把所有液体都加进去！一般先加2mL液体，然后用1mL移液器轻轻将细胞吹起（注意不要有气泡），细胞要像云雾一样散开，这样易于形成单细胞。此外，吹散次数过多也会影响细胞活力，所以要熟练操作，尽快上板。

二、细胞计数

取10 微升加4%台盼蓝计数活细胞。这里不做详细介绍。

三、细胞接种

需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率（IC50）测试时，通常使用96孔板，一方面可以设置浓度梯度；另外还可一次性测多个药物，减少实验误差。

① 稀释细胞：根据细胞计数结果后，将细胞稀释到目的浓度。

获得细胞悬液后要先根据选择的培养板的种类，以及要种的细胞密度调整细胞悬液的浓度，可在离心管中调整后反复颠倒摇匀，种板需要一步完成，切不可先加细胞后补液或先加液再补细胞。

tip：细胞密度对于铺板很重要，过密很容易造成细胞居中，细胞浓度过稀会造成细胞难以生长起来。一般进行预实验。

② 加入细胞悬液

（1）铺6孔板，12孔板或24孔板

为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象，通常在每一个孔加少量的无血清培养基，不用太多，浸润孔底即可。一般可加一个孔，浸润，再用移液枪移取，再加入第二个孔，浸润，依此类推。

如果培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，可以多加点液体缓解。

然后加入细胞悬液，从孔的左边靠近底部贴壁慢慢加入，这样加液后，细胞悬液会平铺在整个孔底，细胞分散较均匀，可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象。

细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。如果有抱团的话，用手指从底部轻轻敲打，使之分散。也可以用平板振荡器稍稍振荡一下。

接下来，将板放在水平板面上“十字”形摇匀（上下左右四个方向进行移动，呈十字形状，重复5-6次），这一步很重要！不可以转圈摇，因为细胞会被带到中间。摇匀后要放工作台静置一下，等细胞贴壁了，轻轻移入到培养箱中。

（2）铺96孔板

可用排枪，速度非常快。每孔加入100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部缓慢加入（加样过快容易导致细胞聚集）。加完半边板48孔后，将剩下的未加的细胞悬液再混一下，再继续加剩余的半边板子。

加完所有的时候，盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度，敲三次即可，太大力或次数太多会导致细胞集中成堆。将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，然后静置约5min，放置培养箱。

注意事项：

★ 用排枪吸取时，一定要保证每个枪头吸上来的悬液体积一致。

★ 如果是用于进行MTS等长时间测试时，最外圈应空余出来（中间60孔为最佳，四周的一圈边缘孔不接细胞），加入PBS或细胞悬液（做空白或阴性对照），以防止培养基蒸发引起的边缘效应。

培养箱里面或者外面尽量不要放可以产生振动的仪器，比如蠕动泵、离心机、涡旋器一类的仪器。这些仪器产生的振动对细胞贴壁有影响，也可能会导致细胞贴壁不均匀。

其实细胞铺板不一定都需要单个单个的那么均匀，比如做免疫荧光时，就可以选择铺中间少，周围稍多的板子。而在提取蛋白或者提取RNA的时候有时会选择铺中间多，四周少的板子，因为有些细胞刮刀不好用，没有办法刮到周围的。特别说明一下：这里的多也只是相对于多，细胞也是单层的。

常见问题解答

（1）细胞铺板后，细胞状态不好，可考虑以下几个原因：

①用来铺板的细胞状态不好。

②用来铺板的细胞传代次数太多，有些老化。

③胰酶消化时间过长。

④中和的血清量及时间不够。

⑤支原体污染。

（2）细胞铺板不匀常见原因

①消化过度，导致细胞结团率太高。

细胞状态差时，按照正常时间进行消化时，很容易造成细胞消化过度、细胞整片粘连在一起及结团率过高。这种情况任凭怎么吹打，后期细胞也很难吹打分散！

②细胞吹打次数不够，细胞悬液密度不均匀。

吹打次数不够，容易导致细胞分散局部不均匀，细胞接种必然也是以失败告终；吹打次数过多，容易导致细胞存活率下降，对细胞凋亡、周期等考察细胞增殖的相关实验，会产生明显的偏差

细胞吹打次数建议：不同细胞“皮实”程度不同，建议大家接种前做梯度吹打实验，细胞最小伤害的情况下去接种细胞。

③铺板加样方法错误。

加样方式为倾斜枪头，从孔的左边靠近底部缓慢加入（加样过快同样容易导致细胞聚集）。

（3）如何避免每个孔之间的细胞量不一致？

★ 铺板时，细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来而导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就再混匀一下。

★ 铺板速度尽量快点，在加完半边板后，需要再次将培养皿内剩余的细胞悬液充分混匀再继续铺板。

（4）对于某些容易聚团的细胞，该怎么办？

对于容易聚团的细胞，尽管当时摇匀了，但是静置30min后，取出后将细胞培养板后，肉眼即可见严重的细胞居中抱团现象。

对于这种细胞的铺板，若是时间允许的话，可以降低接种密度，隔一天等细胞多了再进行药物处理或者划线等。

（5）为什么要贴侧壁加入细胞悬浮液？

因为接种之前已将细胞悬液做过充分混匀，直接从侧壁加入能尽量保持细胞悬液的均匀状态；另外贴侧壁加入也能减少孔内气泡的产生。

结语

细胞铺板不难，但是细节很多。鉴于每个人手法不同，培养的细胞特性也因人而异，因此，还需要实践中多多练习。希望大家都能够铺出漂亮的细胞来。